Протокол для измерения Cue реактивности в мышиной модели кокаин использования расстройства

В данном протоколе реактивность на сигналы служит показателем мотивации животного к поиску кокаина после перерыва в его самовведении. Реактивность на сигналы возникает, когда крыса снова подвергается воздействию контекста и сигналов, которые ранее были связаны с внутривенным введением кокаина. Реактивность на сигналы является показателем риска рецидива.

Описанный здесь протокол реактивности на сигналы представляет собой доклинический метод тестирования фармакотерапии, модифицирующей рецидив, а также исследования генетических и средовых факторов, способствующих риску рецидива. Данная оперантная задача на поиск наркотика соответствует многим свойствам употребления наркотиков и рецидива у людей. Оптимизация ключевых параметров, таких как доза кокаина, объем введения и продолжительность инфузии, была проведена для обеспечения фазовой валидности и трансляционной продуктивности.

Для данного протокола используйте самцов крыс линии Sprague Dawley в возрасте примерно восьми-девяти недель, которые прошли акклиматизацию в помещении вивария не менее семи дней. В период акклиматизации содержите крыс парами и проводите с ними ежедневные манипуляции на протяжении всего исследования. Обеспечьте неограниченный доступ к корму в домашних клетках на всех этапах исследования.

Имплантируйте катетеры в яремную вену, используя метод, описанный Кмиотеком и соавторами в их видео JoVE, затем случайным образом распределите крыс по группам получения физиологического раствора или кокаина. Для обучения запрограммируйте графики самовведения кокаина, как описано в текстовом протоколе. Оснастите камеры для обучения двумя выдвижными рычагами отклика, стимулирующим светом над каждым рычагом отклика и комнатным освещением напротив рычагов.

Вводите кокаин или физраствор с помощью инфузионных шприцевых насосов, расположенных вне камеры. Используйте иглы 23 gauge, прикрепленные к шприцам, и полиэтиленовые трубки, заключенные в металлическую пружинную оболочку и присоединенные к катетерам крыс. Кокаин или физраствор вводятся после нажатия активного рычага, но не после нажатия неактивного рычага.

Ежедневно заменяйте растворы. Используйте свежеприготовленные разведения кокаина в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия, рассчитанные с учетом веса каждой крысы. Заполняйте шприц каждой крысы минимум восемью миллилитрами раствора.

Начните с обучения крыс по режиму подкрепления FR1 и перейдите к режиму FR5 после трех дней подряд, в течение которых количество инфузий составляло семь в час при вариабельности общего числа инфузий за сессию менее 10%. Крайне важно ежедневно анализировать данные о поведении при самовведении, чтобы определить момент перевода животного на режим FR5 и проверить проходимость катетера. Одним из наиболее критических этапов протокола является мониторинг самовведения в течение первых 14 дней обучения для подтверждения того, что животное осуществляет самовведение в норме.

Если уровень самовведения резко снижается, вероятно, произошла потеря проходимости катетера крысы. В начале сеанса убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в шприце. Подсоедините шприц к полиэтиленовой трубке и установите его в инфузионный насос.

Осторожно отрегулируйте шприц так, чтобы раствор был равномерно и полностью распределен по полиэтиленовой трубке. Затем подключите крыс к системе подачи и поместите их в соответствующие стандартные камеры оперантного обусловливания, расположенные в вентилируемых звукоизолирующих боксах с вентиляторами. Постоянство условий на протяжении всего эксперимента имеет решающее значение.

Всегда помещайте крысу в одну и ту же камеру и располагайте активный рычаг с одной и той же стороны внутри этой камеры. В течение 14 ежедневных 180-минутных сессий крысы имеют свободный доступ к рычагам и быстро запоминают, какой из них обеспечивает стимуляцию, при условии исправности системы. Каждое нажатие активного рычага по режиму фиксированного соотношения 1 приводит к введению 0,1 мл раствора в течение шести секунд с одновременным зажиганием света в клетке и стимулирующего света над активным рычагом.

Перед введением раствора следует задержка в одну секунду. После каждого введения кокаина или физиологического раствора стимульный свет и инфузионный насос деактивируются на 20 секунд, в течение которых общее освещение остается включенным, а нажатие на рычаг ни к чему не приводит, но фиксируется. Когда свет гаснет, рычаг снова активируется.

Любое нажатие неактивного рычага не приводит к запланированным последствиям. По окончании этой 180-минутной сессии медленными и осторожными движениями извлеките потенциально агрессивную крысу из камеры. Затем промойте её катетер.

В перерывах между сеансами тщательно очищайте камеры. Протирайте все поверхности 70% раствором этанола. По завершении тренировочных сеансов поместите крыс в условия принудительного воздержания на 30 дней, ограничив им доступ к оперантной камере.

Продолжайте ежедневно работать с крысами и мониторить их общее состояние здоровья. После длительного периода воздержания поместите крыс в оперантную камеру на 60 минут, после чего незамедлительно приступайте к извлечению мозга. В ходе данной сессии запустите запланированную программу анализа реакции на сигнал.

Сместите время начала сеансов, чтобы оставить время для извлечения мозга между ними. Важно: запуск помпы должен осуществляться без установленного шприца, чтобы слуховой сигнал помпы оставался частью стимула, но без подачи вещества. Начните этот сеанс в обычном режиме, поместив крысу в камеру для самовведения, в которой проходило обучение.

В этом тесте при нажатии на активный рычаг, который ранее подавал кокаин или физраствор, предъявляются только сигналы по графику FR1. Неактивный рычаг по-прежнему не вызывает никакой реакции. Регистрируйте все предъявления сигналов, нажатия на ранее активный рычаг и нажатия на неактивный рычаг, а также латентный период до первого нажатия на рычаг.

С использованием описанного протокола было проведено исследование, в ходе которого крысы индивидуально переводились с режима FR1 на FR5 по мере соответствия критериям. В группе, получавшей кокаин, крысы постепенно увеличивали количество инфузий до достижения критерия, после чего осуществлялся переход с FR1 на FR5. В ходе теста на реактивность на сигналы, связанные с кокаином, были собраны многочисленные выходные показатели.

Например, крысы, которые ранее самостоятельно вводили себе кокаин, нажимали на ранее активный рычаг гораздо чаще, чем крысы, самостоятельно вводившие физиологический раствор. Другим важным показателем является латентный период до первого нажатия на рычаг. При изменении этого показателя животное может находиться в состоянии физического стресса или испытывать снижение мотивации к самостоятельному введению кокаина.

Задачи на локомоторное поведение могут быть использованы для оценки изменений физического здоровья и дифференциации двигательных нарушений от изменений мотивации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как обучать крыс самостоятельному введению препарата, поддерживать проходимость катетера во время самовведения и оценивать реактивность на стимулы, связанные с препаратом, после периода абстиненции в качестве показателя риска рецидива. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости тщательного программирования программного обеспечения, правильного обращения с животными и регулярного промывания внутривенных катетеров.

После выполнения данной процедуры можно оценить клеточные и молекулярные механизмы, определяющие реактивность на стимулы, связанные с кокаином, а также протестировать потенциальные фармакологические препараты, модифицирующие эту реактивность.