Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

Целью данной процедуры является изоляция и идентификация клональных линий клеток с нокаутом, полученных двумя типами редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9. Один метод позволяет выявить нокаут белка, вызванный негомологичным соединением концов, в то время как другой обнаруживает геномные изменения, созданные путем гомологичной рекомбинации. Данный метод особенно полезен в области молекулярной биологии, где создание клеточных линий с генетическими модификациями является важным инструментом для изучения функций генов.

Основным преимуществом данного метода является его быстрота и относительно высокая пропускная способность, а также простота выполнения с использованием базовых методов молекулярной биологии. Негомологичное соединение концов приводит к возникновению небольших делеций или инсерций, которые оценивают с помощью дот-блоттинга, в то время как гомологично-направленная репарация позволяет вносить более крупные и точные изменения, которые оценивают с помощью ПЦР-анализа колоний. В данном эксперименте используются клетки T-REx-293, культивируемые в среде DMEM с добавлением 10% FBS при 37 °C и 5% CO2.

Перед трансфекцией высейте клетки в 6-луночные планшеты, выделив одну лунку для нетрансфицированного контроля. Культивируйте клетки до достижения примерно 70% конфлюэнтности. Проведите трансфекцию клеток 2.5 µg суммарно плазмид, следуя коммерческому протоколу трансфекции.

Для трансфекции клеток без селекции используйте 2,5 µg плазмиды Cas9-sgRNA. Для трансфекции клеток с селекцией используйте 0,75 µg Cas9-sgRNA1, 0,75 µg Cas9-sgRNA2 и 1 µg матрицы для гомологичной рекомбинации. Инкубируйте трансфецированные клетки и нетрансфецированный контроль при 37 °C и 5% CO2 в течение 48 часов.

Для клеток, трансфектированных с целью селекции, начните селективный отбор, обработав клетки соответствующим препаратом, в данном случае — неомицином. Верните 6-луночный планшет в инкубатор. Наблюдайте за обработанными клетками один раз в день, чтобы контролировать уровень гибели клеток, пока все клетки в контрольной группе нетрансфектированных клеток не погибнут.

Для изоляции клональных популяций сначала доведите клетки в исходной лунке до 100% конфлюэнтности после селекции. Затем проведите серийные разведения клеток и подсчитайте их количество. Поскольку правильное формирование моноклональных колоний является ключевым условием для получения полного нокаута, необходимо тщательно определить подходящее разведение для посева клеток с требуемой плотностью.

После определения правильного разведения распределите клетки по 96-луночным планшетам с плотностью 0,33 клетки на лунку. Для обеспечения изоляции более одного подходящего клона рекомендуется начать с посева трех 96-луночных планшетов. В течение двух-четырех недель наблюдайте за колониями до тех пор, пока они не станут видны невооруженным глазом.

На этих репрезентативных изображениях показаны колонии на разных стадиях роста: одна клетка при посеве, клетки на пятый день и сформировавшаяся колония на 10-й день. С помощью стерильного наконечника пипетки осторожно и точно перенесите видимые колонии в новые лунки для обеспечения монослойного роста.

Продолжайте культивировать клетки при 37 °C и 5% carbon dioxide. Кандидаты на нокаут без селекции скринируются методом дот-иммуноблоттинга для высокопроизводительного анализа белкового продукта. После того как отдельные клоны достигнут 50–100% конфлюэнтности, отделите монослой клеток путем пипетирования внутри лунки.

Перенесите аликвоту объемом 90 µL из общего объема 100 µL из каждой лунки в чистую микроцентрифужную пробирку. Для целей данного видео будут обработаны только два образца. Центрифугируйте при 6 000 RPM в течение пяти минут, удалите среду и лизируйте осадок клеток в 10 µL 1X SDS-буфера для нанесения.

Добавьте 90 µL свежей среды к оставшимся клеткам в лунке и верните планшет в инкубатор для продолжения культивирования клеток. Нанесите дозатором 1 µL клеточного лизата на сухую нитроцеллюлозную мембрану, чтобы образовалось пятно. Выполните блоттинг каждого образца дважды на двух отдельных мембранах, создавая две идентичные схемы расположения образцов.

Блокируйте мембраны в 5% растворе молока в TBST при комнатной температуре в течение одного часа на качалке. Через один час инкубируйте мембраны с первичными антителами в рекомендуемом разведении в TBST с добавлением 5% молока. На одной мембране используйте первичные антитела к целевому белку, в данном эксперименте — ELAVL1.

На другой мембране используйте первичный антитело к контрольному белку, уровень которого не должен изменяться; в данном случае используется PUM2. Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Удалите раствор первичных антител с каждого блота, добавьте TBST и инкубируйте в течение пяти минут.

Таким образом, промойте блоты трижды с помощью TBST. Затем нанесите на каждую мембрану соответствующее вторичное антитело, конъюгированное с HRP, и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. По истечении часа промойте мембраны трижды с помощью TBST по пять минут за каждую процедуру.

Нанесите раствор хемилюминесцентного субстрата на блоты согласно инструкциям производителя и визуализируйте мембраны с помощью цифрового хемилюминесцентного имиджера. В завершение количественно определите интенсивность точек для целевых и контрольных белков с использованием соответствующего программного обеспечения и проанализируйте результаты, как описано в текстовом протоколе. Кандидаты с селективным маркером резистентности отбираются с помощью колонийной ПЦР.

Начните выполнение данной процедуры с дублирования отдельных колоний в новый 96-луночный планшет и их выращивания до 100% конфлюэнтности для подготовки клеточных лизатов. Удалите среду из одного набора клонов, ресуспендируйте клетки из каждой лунки в 30 µL экстракционного буфера из коммерческого набора для выделения ДНК и перенесите в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Нагрейте раствор до 96 °C в течение 15 минут, затем охладите до комнатной температуры.

Добавьте по 30 µL стабилизирующего буфера в каждую микроцентрифужную пробирку и тщательно перемешайте. Для идентификации линий дикого типа, а также моноаллельных или биаллельных мутантных линий с помощью ПЦР-скрининга колоний разработайте два отдельных набора праймеров для амплификации участков вокруг плеч гомологии в зависимости от успешной или неудачной интеграции кассеты устойчивости. С каждой стороны используйте общий праймер, который отжигается за пределами плеча гомологии.

Для тестирования аллеля дикого типа используйте общий праймер вместе с соответствующим парным праймером, комплементарным эндогенной последовательности, охватывающей область гомологии. Для проверки наличия искомой мутации используйте общий праймер с другим парным праймером, комплементарным вставленной кассете резистентности. Для каждого исследуемого образца подготовьте реакционную смесь, содержащую следующие компоненты: 0.5 µL клеточного лизата, 1.25 µL 10X буфера KOD, 0.75 µL 25 mM сульфата магния, 1.25 µL 2 mM dNTP, 0.375 µL прямого праймера, 0.375 µL обратного праймера, 0.25 µL полимеразы KOD и 7.75 µL воды.

Проведите ПЦР при следующих условиях: 95 °C в течение двух минут, затем 25 циклов: 95 °C в течение 20 секунд, температура отжига праймеров в течение 10 секунд и 70 °C в течение 20 секунд на каждую КБ. Впоследствии визуализируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Для создания линий с нокаутом ELAVL1 было выполнено редактирование генома с помощью негомологичного соединения концов, после чего провели дот-блоттинг с зондированием на ELAVL1 и PUM2. Клоны, в которых наблюдался слабый контрольный сигнал, были отмечены знаком X и исключены из дальнейшего анализа.

Клоны с низким уровнем сигналов ELAVL1 были дополнительно протестированы с помощью вестерн-блоттинга. Подтвержденные кандидаты отмечены зеленым цветом, а исключенные кандидаты — серым. На данном графике отношения сигналов ELAVL1 к контрольному белку представлены в порядке возрастания.

В большинстве случаев клональные популяции с самым низким относительным сигналом ELAVL1 были верно идентифицированы как нокауты. Кандидаты, полученные методом гомологичной рекомбинации, проходили скрининг с помощью колоний-ПЦР, а продукты ПЦР визуализировались с помощью электрофореза в агарозном геле. Представлены примеры результатов с использованием праймеров, перекрывающих участок верхней границы интеграции, с применением эндогенных внутренних праймеров и внутренних праймеров для нокаута.

Сначала праймеры были валидированы как в родительских клетках, так и в пуле селектированных клеток. Результаты для 24 отдельных кандидатных клонов представлены вместе с ожидаемыми паттернами полос для клонов дикого типа, нокаута и моноаллельной делеции. Черные стрелки указывают на правильные продукты амплификации, звездочки обозначают клоны с биаллельным нокаутом.

Биаллельные мутантные линии были дополнительно валидированы с помощью вестерн-блоттинга. Негомологичное соединение концов использует один разрез Cas9 и скрининг, не зависящий от селекции, что требует минимальной предварительной подготовки, а поиск нокаутных клонов с помощью дот-блоттинга позволяет быстро определить успешность создания поколения нокаутов. Скрининг на основе ПЦР точно выявляет подходящих кандидатов с крупными геномными перестройками, созданными путем гомологично-направленной репарации.

Эти методы позволяют исследователям в области молекулярной биологии легко и эффективно идентифицировать нокауты, что дает возможность изучать нормальные или нарушенные клеточные процессы с использованием клеточных линий. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и идентифицировать клональные нокаутные клеточные линии, полученные с помощью редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9.