Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids
11 августа 2017 г.
Мы предоставляем обобщенных протокол, основанный на стратегии microfluidic подложке для инженерных microfibrous сосудистого русла, где тип средней ячейки можно далее посеяны в интерстициального пространства этой microfibrous структуры для создания васкуляризированной ткани и organoids.
Общая цель этой методологии микрофлюидной биопечати заключается в создании васкуляризированной тканевой конструкции. Этот метод может решить ключевые вопросы в области биопроизводства васкуляризированных тканей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он универсален в создании трехмерного сосудистого чана с контролируемой формой для инженерии васкуляризированных тканей с помощью процесса вторичного посева клеток.
Хотя этот протокол дает представление о создании васкуляризированных тканей сердца, он также может быть применен ко многим другим типам тканей, таким как печень, кожа и даже рак. Обычные люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что настройка биопринтера может быть непростой. Чтобы начать эту процедуру, сконструируйте двухслойную концентрическую микрофлюидную печатающую головку, вставив меньшую тупую иглу, служащую сердцевиной, в центр более крупной тупой иглы, служащей оболочкой.
Следите за тем, чтобы стержень иглы выступал из внешней оболочки примерно на один миллиметр. После этого вставьте иглу 23 калибра в ствол центральной иглы в обратном направлении. Сделайте отверстие сбоку от туловища от внешней иглы и вставьте соответствующий по размеру металлический соединитель
.Заклеить эпоксидным клеем. Установите экструдер на головку биопринтера с помощью держателя из полиметилметакрилата или ПММА. Затем для впрыска биочернил и сшивающего раствора через две трубки из ПВХ по отдельности подключите входные отверстия печатающей головки к двухканальному шприцевому насосу.
Сделайте биочернила, используя смесь альгината, гельМА и фотоинициатора. Растворен в 25 миллимолярном буфере HEPES, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки или FBS. Затем приготовьте раствор 0,3 моляра хлорида кальция в буфере HEPES, содержащем 10% FBS, в качестве сшивающей несущей жидкости.
Непосредственно перед биопечатью трипсинизируйте эндотелиальные клетки пупочной вены человека или HUVEC в течение 5-10 минут. Центрифугируйте клетки при 800 об/мин в течение пяти минут в 15-миллилитровой пробирке. Ресуспендируйте клетки в биочернилах в концентрации от пяти до 10 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр, медленно пипетируя от пяти до 10 раз.
Затем с помощью двухканального шприцевого насоса начните впрыскивание биочернил HUVECs через один канал, а сшивающей жидкости через другой канал со скоростью потока пять микролитров в минуту. Дайте потокам непрерывно работать в течение одной минуты, пока они не стабилизируются. После этого начните движение печатающей головки, поддерживая скорость наплавки биопринтера на уровне примерно четырех миллиметров в секунду.
Эта биопечать должна привести к быстрому ионному гелеобразованию альгинатного компонента и осаждению каркаса из микрофибры. После того, как каркас будет напечатан, сшите компонент gelMA с помощью ультрафиолетового излучения мощностью от 5 до 10 милливатт на квадратный сантиметр в течение 20-30 секунд для достижения химического гелеобразования. Затем удалите излишки хлорида кальция со скаффолда, аккуратно промыв его теплой температурой 37 градусов Цельсия PBS.
Культивируйте этот каркас в среде для роста эндотелиальных клеток при температуре 37 градусов Цельсия в пяти объемных процентах CO2 в течение 16 дней. Меняйте среду не реже одного раза в два дня. В период культивирования наблюдайте за HUVEC под микроскопом до тех пор, пока они не мигрируют на периферию микроволокон каркаса и не образуют просветоподобные структуры.
Затем осторожно удалите всю среду из внутритканевого пространства каркаса с капиллярной силой с помощью куска стерильной фильтровальной бумаги. Мгновенно добавьте каплю суспензии вторичного типа клеток, таких как кардиомиоциты, поверх каркаса, что позволит клеткам проникнуть во все интрастициальное пространство. После этого инкубируйте этот каркас в инкубаторе от 30 минут до двух часов, позволяя клеткам прилипнуть к отдельным микроволокнам.
Удалите неадгезивные клетки, аккуратно промойте каркас PBS. Культивируйте этот каркас в соответствующей среде до тех пор, пока не сформируется желаемая васкуляризированная ткань. Описанная здесь микрофлюидная биопечать позволяет проводить прямую биопечать микроволокнистых каркасов с использованием биочернил с низкой вязкостью.
Каркас размером шесть на шесть на шесть квадратных миллиметров<содержащий более 30 микроволокон, может быть напечатан на биопринтере в течение 10 минут. Вид сверху и сбоку микрофотографий каркаса показывает превосходную структурную целостность в процессе биопечати. Достигается за счет немедленного ионного сшивания альгинатного компонента с хлоридом кальция.
После микрофлюидной экструзии биочернил, ионного сшивания и фотосшивки HUVEC сохранили относительно высокую жизнеспособность. Клетки пролиферировали и мигрировали из первоначально случайного распределения в нулевой день на периферию микроволокон на 16-й день. Кардиомиоциты неонатальных крыс, которые были посеяны на каркасе, созрели и заселили каркас.
Они показали сильную экспрессию функциональных сердечных биомаркеров. Такие как саркомерный альфа-актинин и коннексин 43. Конфокальная микроскопия биопечатного микрофиброзного каркаса, населенного кардиомиоцитами, выявила сосуществование как HUVEC, так и кардиомиоцитов.
HUVEC в основном присутствуют в границах микроволокон, в то время как кардиомиоциты окружают внешнюю часть микроволокон. Клетки были способны поддерживать свое спонтанное и синхронное биение в течение от девяти до 28 дней. В зависимости от источника ячеек и конфигурации скаффолдов.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить васкуляризированные ткани с помощью метода микрофлюидной биопечати, а также о изготовлении печатающей головки и операциях биопринтера. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку изготовление печатающей головки и работа биопринтера могут быть сложными для людей, которые раньше им не пользовались. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что две иглы должны быть концентрическими в печатающей головке и дать потоку стабилизироваться перед началом биопечати.
С развитием этого метода исследователи в области тканевой инженерии и биопроизводства теперь имеют еще один инструмент, позволяющий создавать васкуляризированные тканевые конструкции либо с целью регенерации in vivo, либо для моделирования тканей in vitro.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика микрофлюидного биопринтинга, направленная на создание васкуляризированных тканеинженерных конструкций. Этот метод позволяет решать проблемы биофабрикации, обеспечивая создание трехмерного сосудистого русла, которое может быть заселено вторичными типами клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биофабрикация
- Микрофлюидика
- Тканевая инженерия
Теоретические сведения
- Создание васкуляризированных тканей имеет решающее значение для развития органоидов.
- Современные методы сталкиваются с ограничениями при создании сложных тканевых структур.
- Микрофлюидная биопечать предлагает универсальный подход к решению этих проблем.
- Данная методика может быть адаптирована для различных типов тканей, включая ткани сердца, печени и кожи.
Цель исследования
- Разработать протокол создания васкуляризированных тканевых конструктов.
- Углубить понимание методов биофабрикации.
- Создать основу для будущих применений в области тканевой инженерии.
Используемые методы
- Создание двухслойной концентрической микрофлюидной печатной головки.
- Использование более тонкой тупоконечной иглы в качестве сердечника внутри более толстой тупоконечной иглы.
- Посев вторичных типов клеток в микроволокнистую структуру.
- Применение данного метода к различным типам тканей, помимо тканей сердца.
Основные результаты
- Протокол позволяет успешно создать васкуляризированную тканевую конструкцию.
- Продемонстрирована универсальность метода при создании различных типов тканей.
- Получены новые данные о проектировании сложных тканевых структур.
- Определены потенциальные трудности для начинающих специалистов в области биопечати.
Выводы
- Метод микрофлюидного биопринтинга эффективен для создания васкуляризированных тканеинженерных конструкций.
- Данный подход может способствовать прогрессу в исследованиях органоидов.
- Будущие исследования могут расширить область применения этого метода на другие типы тканей и условия.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Микрофлюидная биопечать позволяет создавать васкуляризированные тканевые конструкции с высокой структурной точностью, что устраняет критический барьер в разработке доклинических моделей. Путем формирования перфузируемых микрососудистых сетей внутри гидрогелевых каркасов этот метод обеспечивает создание более физиологически релевантных моделей тканей для скрининга лекарственных препаратов и изучения механизмов их действия. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки, предоставляя настраиваемую платформу для изучения межклеточных взаимодействий, созревания тканей и функциональных ответов в контролируемых условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия между эндотелиальными клетками и перицитами или стромальными клетками в определенной сосудистой нише для подтверждения терапевтических мишеней, участвующих в ангиогенезе или регуляции сосудистой проницаемости.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимую систему с микрофлюидным контролем для создания васкуляризированных каркасов с однородной архитектурой микроволокон и формированием просвета.
- Прогностическая ценность: позволяет оценивать влияние соединений на целостность сосудов и миграцию клеток в соответствующей человеку трехмерной микросреде (3D).
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет создавать стандартизированные микроволоконные каркасы с инкапсулированными эндотелиальными клетками, которые формируют просветы, подобные сосудистым, что обеспечивает количественную оценку формирования сосудистой сети с течением времени.
- Практическая ценность: совместимость с двухканальным шприцевым насосом для биопечати обеспечивает точный контроль подачи биочернил и сшивающего раствора для высокопроизводительного изготовления каркасов.
- Готовность анализа: позволяет получать каркасы с количеством микроволокон >30 в объеме 6x6x6 мм в течение 10 минут, что обеспечивает масштабируемую подготовку для последующего посева вторичных клеток и скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает возможность вторичного посева кардиомиоцитов или других паренхимальных клеток в интерстициальное пространство, что облегчает изучение созревания васкуляризированной ткани и синхронизированной сократительной функции.
- Трансляционная преемственность: поддерживает долгосрочное культивирование (>16 дней) с мониторингом миграции клеток, формирования просвета и экспрессии биомаркеров (например, саркомерного альфа-актинина, коннексина 43) для моделирования реакций на уровне ткани.
- Снижение рисков: позволяет оценивать жизнеспособность, пролиферацию и функциональное созревание клеток в условиях, имитирующих перфузию, что снижает потери из-за плохого приживления сосудов на более поздних этапах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущего соединения, предоставляя васкуляризированную платформу, которая служит связующим звеном между простыми монокультурами и сложными моделями in vivo.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о сосудисто-зависимых путях за счет обеспечения контролируемого совместного культивирования эндотелиальных и паренхимальных клеток в заданной 3D-геометрии.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу каркасы с воспроизводимой микроструктурой и эндотелизацией, пригодные для оценки воздействия соединений на стабильность сосудов и организацию тканей.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные с помощью конфокальной микроскопии распределения клеток, формирования просвета и колокализации биомаркеров для оценки качества и функционального созревания тканей.
- Трансляционные исследования: моделирует развитие васкуляризированной ткани — от раннего формирования эндотелиальной сети до интеграции вторичных клеток, что поддерживает доклиническую валидацию кандидатов для таргетной сосудистой или регенеративной терапии.
- Корпоративное повторное использование: конструкция микрофлюидного печатного узла и система биочернил (GelMA-альгинат с ионным/фотосшиванием) представляют собой универсальную платформу, адаптируемую для различных типов тканей (сердца, печени, кожи) и вторичных типов клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов за счет создания васкуляризированных тканей с перфузируемыми люменоподобными структурами и стабильной функцией клеток (например, синхронным сокращением до 28 дней).
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию изготовления скаффолдов с помощью микрофлюидного контроля потока, что снижает вариативность диаметра микроволокон, эффективности сшивания и распределения клеток.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя ранние данные о совместимости сосудов и реакциях на уровне тканей, что снижает вероятность неудач на поздних этапах из-за недостаточной васкуляризации.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе их воздействия в релевантной для человека модели васкуляризированной ткани, которая воспроизводит ключевые структурные и функциональные характеристики.
Особенности реализации
- Требуется опыт изготовления микрофлюидных устройств, включая сборку концентрических игл и герметизацию эпоксидным компаундом для предотвращения утечек.
- Зависимость от двухканальных систем шприцевых насосов и оборудования для УФ-фотосшивки для точного подачи биочернил и стабилизации GelMA.
- Необходима оптимизация концентрации клеток (5–10×10⁶ HUVECs/mL) и скорости потока (5 µL/min) для обеспечения жизнеспособности клеток и равномерного инкапсулирования в процессе печати.
- Требуется соблюдение правил асептики и использование стерильной фильтровальной бумаги для удаления среды при вторичном посеве клеток, чтобы избежать контаминации и обеспечить надлежащую инфильтрацию.
- Ограничение, связанное с необходимостью промывки после печати для удаления избытка хлорида кальция, что добавляет ручной этап, который должен быть стандартизирован для всех партий.
