Морфометрические и клеточного анализа метод для мышиных нижней челюсти мыщелка

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за эффектами сжимающей нагрузки в мыщелковом хряще нижней челюсти мышей с использованием морфометрических измерений на рентгенограммах и гистологическом анализе. Эти показатели могут помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся структурных и клеточных изменений в мыщелке нижней челюсти грызунов. Основное преимущество показанной здесь методики заключается в том, что их можно использовать для анализа других мелких или рожденных животных.

Для этого протокола подготовьте изолированные, препарированные мышиные мандибулы, готовые к использованию. На чашке Петри перенесите нижние челюсти в систему рентгеновского кабинета. Затем сделайте рентгенограммы при напряжении 26 киловольт в течение пяти секунд.

Теперь откройте изображения в программном обеспечении для анализа, чтобы выполнить морфометрические измерения. Во-первых, используйте кнопку единиц измерения для настройки масштабной линейки. Далее выделите шесть анатомических точек, используя стиль маркера 2.

Сначала выберите самые задние точки мыщелка нижней челюсти в качестве первой. Далее выберите разрезанный отросток для пункта два. Затем выберите самую глубокую точку на сигмовидной выемке для точки три.

Затем выберите самую глубокую точку в вогнувности ветви нижней челюсти, точку четыре, а затем выберите самую переднюю точку мыщелковой суставной поверхности, точку пять. Теперь выберите самую заднюю точку мыщелковой суставной поверхности в качестве точки шесть и продолжите измерение длины с помощью инструмента длины. Затем с помощью инструмента «Перпендикулярная линия» от точки три до точки четыре измерьте длину головки мыщелка, которая представляет собой длину перпендикуляра, от точки 1 до линии между точками 3 и 4.

Затем измерьте длину нижней челюсти между первой и второй точками. Наконец, измерьте ширину мыщелка, которая находится между пятью и шестью точками. Чтобы сохранить данные, скопируйте список измерений в правой части экрана.

Прежде чем вставлять фиксированные, но не очищенные от накипи, замочите их на ночь в 30-процентной сахарозе в PBS. На следующий день удалите лишние мягкие ткани и осторожно разрежьте мыщелок нижней челюсти. Теперь поместите образцы в пластиковые формы так, чтобы медиальная поверхность мыщелка прилегала к основанию формы, а образец был параллелен дну формы.

Затем погрузите их в засыпную смолу и охладите смолу с помощью куска сухого льда. Затем полейте формочки еще большим количеством смолы для заделки. Переложите их в холод с двумя метилбутанами, охлажденными морозилкой или сухим льдом.

После охлаждения храните образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия для разделки. Чтобы количественно оценить экспрессию Col10a1 в MCC сагиттальных срезов мыщелков, откройте гистологические изображения в программном пакете для анализа изображений и выберите область интереса с помощью инструмента лассо. В этом случае выбирается регион MCC.

Обратите внимание на количество пикселей в области, которое указано в поле гистограммы. Далее выберите красные пиксели Col10a1, настроив цветовую гамму. С помощью пипетки выберите красный пиксель на изображении и нажмите OK. Затем запишите количество красных пикселей в области, как указано в поле гистограммы.

Доля красных пикселей в области представляет собой объем выражения Col10a1. Теперь, используя ту же базовую методику, количественно оцените активность TRAP в MCC и субхондральной кости. Во-первых, выберите хрящи в субхондральных областях костей в качестве областей для анализа и обратите внимание на общее количество пикселей.

Затем выберите желтые пиксели, сгенерированные подложкой ELF97. Обратите внимание на количество положительных пикселей и вычислите долю положительных пикселей TRAP. Теперь количественно определите EDU-положительные клетки, которые окрашены в синий цвет с помощью DEPI.

Снова выберите область интереса, а затем количественно оцените синие пиксели внутри нее. Также используйте этот метод для определения количества положительных пикселей EDU в той же области. Морфометрические измерения мышей, подвергшихся компрессионному нагружению ВНЧС, показали, что при нагрузке значительно увеличивалась длина нижней челюсти и головки мыщелка.

Тем не менее, нагружение не привело к существенному изменению ширины мыщелка. Количественная оценка распределения коллагена выявила значительное увеличение экспрессии Col10a1 и MCC мыщелков загруженных животных. С другой стороны, экспрессия Col2a1 мало чем отличалась от контрольной.

Активность TRAP увеличивалась в субхондральной области мыщелков и нагруженных мышей, как и субпролиферация. Окрашивание EDU обозначает количество пролиферативных клеток. Распределение протеогликанов в MCC количественно оценивали путем оценки области окрашивания толуидином в синий цвет и карты расстояний.

Отмечено значительное увеличение картографирования расстояний в МКЦ мыщелков нагруженной группы. Тем не менее, область, окрашенная протеогликанами, статистически не различалась между группами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать клеточные и структурные изменения в мыщелке нижней челюсти грызунов.