Простой и недорогой Assay для измерения передвигаться в моделях мыши мышечной дистрофии
29 декабря 2017 г.
Этот протокол описывает гибкий, лоу кост системы для измерения мыши передвигаться в открытом поле деятельности assay. Мы показывают, что 6-минутный передвигаться пробирного, основанными на этой системе обнаруживает снижение добровольного движения в многомерных выражений мышей и точно отличает улучшение мышц конкретных спасения этих животных.
Общая цель данного анализа заключается в измерении произвольной локомоции на мышиных моделях мышечной дистрофии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения мышечной дистрофии, касающиеся прогрессирования мышечной слабости у мышей-моделей и эффективности потенциальных терапевтических средств. Основным преимуществом данной методики является обеспечение неинвазивного и воспроизводимого измерения двигательной активности животных, которое может быть легко адаптировано к различным условиям исследований.
В тихом помещении с регулируемым температурным режимом, в одно и то же время суток, установите камеру на проволочную сетку над камерой для мониторинга активности, чтобы обеспечить запись всей площади арены, и обработайте камеру дезинфицирующим средством. Непосредственно перед записью активности позвольте мыши ухватиться за штангу цифрового динамометра и осторожно тяните ее назад, пока мышь не отпустит штангу. Для каждого испытания фиксируйте пиковое напряжение в Newtons.
С интервалом в одну минуту отдыха между испытаниями. Сразу после анализа силы хвата поместите мышь в камеру и начните видеозапись, позволяя мыши свободно исследовать пространство. Через шесть минут остановите запись и верните мышь в домашнюю клетку.
Для проведения трекинг-анализа видеоданных сначала откройте запись в подходящем программном обеспечении для редактирования видео и установите скорость воспроизведения в два раза выше нормальной. Экспортируйте прореженное видео в формате mp4 для последующего анализа и откройте его в соответствующей программе для видеоанализа. Чтобы выполнить калибровку видеозаписи, используйте инструмент «линия», чтобы провести линию вдоль одной из сторон камеры.
Щелкните правой кнопкой мыши по линии, выберите «calibrate measure» (калибровка измерения) и введите фактический размер стенки камеры в сантиметрах. Чтобы начать полуавтоматическое отслеживание положения мыши, нажмите на «move cursor» (переместить курсор). Начиная с первого кадра видео, щелкните правой кнопкой мыши по точке, которую необходимо отслеживать.
Точка отслеживания будет отмечена синим кругом. Используйте правую стрелку на клавиатуре для перехода к следующему кадру. Точка отслеживания должна перемещаться автоматически в зависимости от положения основания хвоста.
Если положение отслеживания в конкретном кадре не совпадает с интересующей точкой, вручную совместите синий круг с положением отслеживания. После того как будет отслежено всё видео, сохраните видео и наложенный слой трассировки, затем выберите «экспорт в таблицу» (export to spreadsheet), чтобы экспортировать позиционные данные трассировки. В соответствии с результатами, полученными в аналогичных анализах, мыши линии mdx с отсутствием дистрофина, подвергнутые протоколу физических нагрузок непосредственно перед тестированием, демонстрируют значительно меньшую произвольную двигательную активность в шестиминутном тесте «открытое поле» по сравнению с животными дикого типа.
Действительно, после умеренной нагрузки в тесте на силу хвата мыши mdx обычно оставались неподвижными в течение первых нескольких минут протокола оценки локомоторной активности, с незначительным увеличением двигательной активности к четвертой-пятой минуте. Однако при сравнении животных дикого типа и мышей mdx без предварительной физической нагрузки различий в пройденном расстоянии не обнаруживалось. Мыши mdx с трансгенной экспрессией утотрофина не отличались от животных дикого типа: не было выявлено значимых различий ни в общем пройденном расстоянии, ни в любой из наблюдаемых кумулятивных временных точек.
Для определения эффекта снижения частоты дискретизации была измерена общая дистанция, пройденная животным за одну минуту видеозаписи с полной частотой кадров, и сопоставлена с измерениями дистанции, полученными из версий набора данных с пониженной частотой дискретизации. Снижение частоты кадров в два раза привело к уменьшению измеренной дистанции на 5% от первоначально рассчитанного значения. Точность измерения дистанции резко падает после этой точки, хотя даже сильно децимированные наборы данных все еще близко аппроксимируют траекторию животного, что подчеркивает важность учета частоты кадров и обработки сигнала при оценке активности животных и демонстрирует, что в видеоданных с пониженной частотой дискретизации может сохраняться высокое пространственное разрешение.
После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как регистрировать и анализировать перемещение мышей в условиях открытого поля. При должном навыке и правильном выполнении этот анализ может быть завершен за 15–30 минут. Данный недорогой и неинвазивный метод позволяет исследователям изучать двигательную активность на моделях мышей с мышечной дистрофией и может служить информативным первым этапом для дальнейших функциональных измерений.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается гибкая и недорогая система для измерения локомоторной активности мышей в тесте «открытое поле». Этот метод обеспечивает неинвазивное и воспроизводимое измерение активности животных и может быть адаптирован к различным условиям исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Исследование мышечной дистрофии
- Поведенческий анализ
Теоретические основы
- Данный анализ позволяет измерить произвольную локомоцию на мышиных моделях мышечной дистрофии.
- Он дает ответы на ключевые вопросы, касающиеся прогрессирования мышечной слабости.
- Метод разработан для оценки эффективности потенциальных терапевтических средств.
- Регистрация данных проводится в контролируемой среде для обеспечения согласованности результатов.
Цель исследования
- Для измерения произвольных движений у мышей линии mdx.
- Для оценки влияния специфических для мышц вмешательств.
- Для получения данных о прогрессировании мышечной дистрофии.
Используемые методы
- Использование камеры, расположенной над камерой активности, для записи процесса.
- Очистка камеры дезинфицирующим средством перед проведением испытаний.
- Предоставление мыши возможности ухватиться за стержень для измерения пикового натяжения.
- Регистрация активности в течение 6-минутного теста на амбулацию.
Основные результаты
- Система регистрирует снижение произвольной двигательной активности у мышей линии mdx.
- Она позволяет точно дифференцировать улучшения, вызванные специфическим восстановлением функций мышц.
- Результаты воспроизводятся в различных сериях испытаний.
- Метод может быть адаптирован к различным условиям исследований.
Выводы
- Данный анализ эффективен для изучения мышечной дистрофии у мышей.
- Он предоставляет ценные данные об эффективности потенциальных методов лечения.
- Этот подход гибок и может быть использован в различных исследовательских условиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Измерение произвольной локомоции на мышиных моделях обеспечивает трансляционный показатель двигательной функции при мышечной дистрофии, что напрямую аналогично таким клиническим конечным точкам, как тест 6-минутной ходьбы. Этот недорогой анализ на основе видеофиксации позволяет проводить воспроизводимую неинвазивную оценку прогрессирования заболевания и терапевтического ответа в доклинических исследованиях. Выявляя дефицит активности у мышей mdx с отсутствием дистрофина и восстановление функции за счет экспрессии утрофина, данный метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при разработке нейромышечных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественной оценки произвольного передвижения как функционального показателя мышечной силы в моделях дистрофии.
- Операционная ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет воспроизводимой корреляции генотипа и фенотипа у мышей mdx по сравнению с группами дикого типа и группами с восстановленным фенотипом.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля исследований, позволяя выявить эффективные вмешательства (например, трансген утофина), которые нормализуют уровень активности до показателей дикого типа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений с использованием стандартизированных показателей амбулации в открытом поле.
- Воспроизводимость: Получение количественных данных по пройденному расстоянию и времени, что позволяет стандартизировать анализ в разных лабораториях.
- Масштабируемость: Использование бесплатного программного обеспечения с открытым исходным кодом и доступного оборудования, что позволяет повторно использовать платформу в различных исследовательских условиях без необходимости в специализированном оборудовании.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует релевантные для пациентов нарушения локомоции, обеспечивая трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Снижение механистических рисков: Позволяет определить, обусловлены ли наблюдаемые эффекты специфическим восстановлением мышечной функции или неспецифическими изменениями активности.
- Принятие решений с учетом рисков: Обосновывает критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем корреляции восстановления локомоции с взаимодействием с мишенью и модуляцией сигнального пути.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум поиска новых препаратов — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая функциональный связующий этап между молекулярными механизмами и фенотипическими результатами в моделях мышечной дистрофии.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем установления связи между генетическими или фармакологическими вмешательствами и измеримыми изменениями произвольных движений.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимого видеотрекинга, который генерирует количественные показатели локомоции для оценки соединений.
- Аналитика: создает потоки пространственных и временных данных, позволяя исследовательским группам сравнивать локомоторную активность для разных генотипов, вариантов лечения и временных точек.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом путем имитации клинических оценок амбулации, что способствует согласованию биомаркеров и предиктивному моделированию.
- Корпоративное использование: создает возможность многократного использования недорогого метода тестирования амбулации, что снижает зависимость от специализированных базовых центров.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в тестах двигательной функции.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря использованию трекинга с открытым исходным кодом и контролируемым условиям окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет устранения необходимости в дорогостоящих системах отслеживания движений при сохранении качества данных.
- Влияние на портфель: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе функционального восстановления фенотипов амбулации в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Требуются базовые навыки видеозаписи и работы с программным обеспечением для трекинга с открытым исходным кодом (например, ручного покадрового выравнивания).
- Зависит от стандартного оборудования для визуализации и стабильного контроля условий окружающей среды (освещения, температуры, времени суток).
- Необходимо строгое соблюдение протокола всеми командами для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах и разными операторами.
- Требуется учет особенностей адаптации для камер различных размеров, разных линий мышей и уровней активности.
- Предполагает компромисс между частотой кадров и точностью измерений, так как понижение частоты дискретизации снижает точность расчета расстояния.
