Обтекаемый 3D мозжечковой дифференциация протокол с Факультативным 2D модификации
9 декабря 2017 г.
Мы опишем среднего определен протокол для hPSCs, с использованием упрощенных 3D дифференциации и снижение факторов роста, способны генерировать агрегаты клеток с раннего нейроэпителиальных структуры и позитивные мозжечковой связанные маркеры, а также необязательный 2D модификация для дифференциации клеток как однослойная для создания функциональных нейроны.
Общей целью этих культур дифференцировки является создание линий клеток мозжечка в 2D или 3D средах. Эти методы могут помочь ответить на основные вопросы, касающиеся новых разработок или механизмов заболеваний, лежащих в основе расстройств мозга у детей, с использованием стволовых клеток, полученных от пациентов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она отличается простотой запуска и обслуживания с небольшим количеством факторов, а также может быть использована в качестве основы для тестирования более сложных нейронных протоколов. Демонстрировать процедуру будет Лиза, техник из моей лаборатории. Для организации дифференциации с помощью модифицированного метода G-метода пропускания ПСК переносят необходимый объем нервной поддерживающей среды в стерильную трубку и добавляют 4 нанограмма на миллилитр FGF2 и десятимикромольный ингибитор породы. Затем держите среднюю трубку при комнатной температуре или на водяной бане при температуре 37
Обзор
В данной статье представлен упрощенный протокол 3D-дифференцировки человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с использованием определенной среды и пониженной концентрации факторов роста. Данный протокол позволяет получать клеточные агрегаты с ранними нейроэпителиальными структурами и маркерами, связанными с развитием мозжечка.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Дифференцировка клеток
Теоретические основы
- Понимание клеточных линий мозжечка имеет решающее значение для изучения детских заболеваний головного мозга.
- Стволовые клетки, полученные от пациентов, могут дать представление о механизмах развития заболеваний.
- Данный протокол направлен на упрощение процесса дифференцировки.
- Он позволяет использовать как 2D, так и 3D среды культивирования.
Цель исследования
- Разработать простой метод получения типов клеток мозжечка.
- Облегчить проведение исследований заболеваний головного мозга детского возраста.
- Создать основу для более сложных протоколов нейрональной дифференцировки.
Используемые методы
- Использование определенной среды для поддержания нейральных клеток.
- Добавление FGF2 и ингибитора ROCK.
- Культивирование hPSCs в форматах 2D и 3D.
- Мониторинг дифференцировки в направлении линий клеток мозжечка.
Основные результаты
- Успешное получение клеточных агрегатов с нейроэпителиальными структурами.
- Экспрессия маркеров, ассоциированных с мозжечком, в дифференцированных клетках.
- Демонстрация простоты и эффективности протокола.
- Потенциал для дальнейшего применения в комплексных исследованиях нервной системы.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод дифференцировки клеток мозжечка.
- Он может быть адаптирован для различных исследовательских целей в области нейробиологии.
- Будущие исследования могут опираться на эту базу для проведения передовых нейробиологических изысканий.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Данный упрощенный протокол дифференцировки мозжечка снижает сложность и стоимость получения линий клеток мозжечка из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, что способствует валидации мишеней на ранних этапах исследования детских заболеваний головного мозга. Минимизация внешних факторов паттернирования снижает риск появления искажающих фенотипов заболеваний в моделях на основе hPSC, повышая прогностическую достоверность при предварительной оценке рисков мишеней на доклиническом этапе. Гибкость формата (сочетание 2D/3D) обеспечивает возможность масштабирования разработки анализов и согласования трансляционных биомаркеров в рамках рабочих процессов поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с мозжечком, с использованием стволовых клеток, полученных от пациентов, для выяснения механизмов развития заболевания.
- Практическая ценность: снижает неопределенность механизмов за счет упрощения процесса дифференцировки с использованием меньшего количества экзогенных факторов, которые могли бы маскировать фенотипы.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные об экспрессии маркеров, ассоциированных с мозжечком, и притоке ионов кальция для скрининга соединений.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа как в адгезивном 2D-формате, так и в формате свободно плавающих 3D-культур.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Предоставляет релевантные заболеванию клеточные модели со структурами, напоминающими ромбовидную губу и вентрикулярную зону, для доклинической валидации.
- Практическая ценность: Позволяет принимать взвешенные решения о дальнейшем продвижении проекта на основе анализа рисков благодаря стабильной и масштабируемой генерации нейронов мозжечка.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрирован в непрерывный процесс исследований — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, обеспечивая создание клеточных линий мозжечка для механистического скрининга и поиска биомаркеров.
- Биологические исследования: способствует уточнению путей передачи сигнала и снижению биологических рисков при ранней валидации мишеней в мозжечке.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных данных, готовых для анализа, включая экспрессию маркеров и функциональный поток ионов кальция для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить сравнительный анализ эффективности дифференцировки и созревания нейронов при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинических исследований за счет получения релевантных для конкретных заболеваний нейронов мозжечка.
- Корпоративное повторное использование: служит адаптируемой базовой платформой для тестирования оптимизированных протоколов нейральной дифференцировки в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней за счет снижения фенотипического шума и повышения точности модели.
- Операционная ценность: Стандартизация, экономическая эффективность и масштабируемость для 2D- и 3D-систем культивирования.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних этапах в программах по мишеням мозжечка.
- Влияние на портфель: Обеспечение приоритизации мишеней мозжечка с учетом рисков с использованием надежных и масштабируемых моделей заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт культивирования стволовых клеток и навыки составления рецептур определенных сред.
- Зависит от наличия доступа к FGF2, ингибитору ROCK и инфраструктуре для подготовки поддерживающей среды для нейронов.
- Необходима стандартизация между группами для обеспечения согласованности при переходе от 2D- к 3D-формату.
- Требуется учет особенностей адаптации при переходе от монослойных культур к культурам органоидоподобных агрегатов.
- Ограничено необходимостью проведения функциональных валидационных анализов, помимо экспрессии маркеров, для подтверждения зрелости нейронов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
3D "Organoid" Differentiation
4:32
Alternative 2D Differentiation Culture
8:28
Results: 3D Products Exhibit Markers and Structures of Early Neuroepithelium, and 2D Products Exhibit Cerebellar Markers and Functional Neuronal Activity
9:48
Conclusion
