Поверхности функционализации наночастиц вирус гепатита Е, используя методы химической спряжение

Общая цель химической функционализации поверхности наночастиц HEV заключается в создании воспроизводимого и согласованного подхода к конъюгации таргетных иммуногенных, терапевтических и диагностических молекул с поверхностью наночастиц HEV для целей диагностики и лечения.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области наномедицины, такие как способы мониторинга улучшенного таргетинга раковых клеток и распределения нанотерапевтических препаратов. Главным преимуществом данной методики является ее высокая воспроизводимость, эффективность и значительно большая простота реализации по сравнению с методами генетической инженерии.

Процедуры продемонстрируют Мишель Нгуен и Иван Руис, научные сотрудники нашей лаборатории.

Начните выполнение данного протокола с получения и очистки наночастиц вируса гепатита E, как описано в текстовом протоколе.

Разбавьте образцы наночастиц HEV с 10 мМ MES (pH 6.2) до концентрации от 0.5 до 2 мг/мл для ПЭМ-визуализации. Ионизируйте сеточки с углеродным покрытием с помощью тлеющего разряда при токе 40 мА в течение 30 секунд для создания гидрофильной углеродной поверхности. Гидрофильные свойства поверхности сеточек сохраняются в течение всего 30 минут после обработки тлеющим разрядом. После ионизации, удерживая сеточку пинцетом, нанесите на неё 2 мкл образца наночастиц HEV.

Через 15–30 секунд промокните сетку фильтровальной бумагой. Затем немедленно промойте сетку дважды дистиллированной водой и снова промокните фильтровальной бумагой. Сразу же нанесите на сетку 2 µL 2% раствора уранил-ацетата. Через 15 секунд промокните сетку фильтровальной бумагой. Высушите сетки с образцами, поместив их в электронный осушительный шкаф на ночь.

В зависимости от образца для визуализации и характеристики структуры может потребоваться криоэлектронная микроскопия или cryo-EM. Перенесите сетку в ПЭМ и выполните съемку при увеличении от 10 до 80K. На ПЭМ-изображениях наночастицы HEV выглядят как пустые икосаэдрические белки диаметром примерно 27 nanometers из-за отсутствия вирусной РНК.

Для проведения одноэтапного конъюгирования наночастиц HEV с биотином, связанным через малеимид, сначала поместите наночастицы HEV в мини-диализные установки. Проведите диализ наночастиц против 0,01 М PBS pH 7,4 при комнатной температуре в течение одного часа в соответствии с протоколом производителя. После диализа перенесите наночастицы HEV в пробирки объемом 1,5 мл и измерьте концентрацию белка при 280 нм с помощью спектрофотометра. Смешайте наночастицы в концентрации 1 мг/мл с равным объемом 100 мкМ малеимид-биотина и 0,01 М PBS pH 7,4 для достижения молярного соотношения от 1:1 до 1:5. После инкубации в течение ночи при 4 °C удалите несвязанный малеимид-биотин с помощью колонки для спин-опреснения согласно протоколу производителя. Проанализируйте образцы с помощью стандартного восстанавливающего SDS-PAGE.

Используя стандартные процедуры, проведите химилюминесцентный вестерн-блоттинг с применением стрептавидина, конъюгированного с HRP, и зафиксируйте химилюминесцентный сигнал на рентгеновской пленке.

Для проведения двухэтапной конъюгации лиганда LXY30, специфичного к клеткам рака молочной железы, с экспонированным на поверхности цистеином наночастиц HEV, сначала поместите наночастицы в мини-диализные установки и проведите диализ против 0,01 M PBS pH 7,4 при комнатной температуре в течение одного часа. Затем перенесите наночастицы HEV в пробирки объемом 1,5 мл и измерьте концентрацию белка при 280 нм с помощью спектрофотометра. Далее смешайте 650 µM малеимид-азида и 650 µM алкин-LXY30 с 200 µM сульфата меди и 1 mM аскорбиновой кислоты. В результате образуется maleimide-linked-LXY-30 в концентрации 650 µM. Инкубируйте смесь при 4 °C в течение ночи. На следующий день смешайте наночастицы HEV в концентрации 1 mg/mL с примерно 10% по объему maleimide-linked LXY30 для достижения молярного соотношения от 1 до 3. Проведите реакцию в течение ночи при 4 °C. Из-за относительно высокой концентрации maleimide LXY30 конечные концентрации таких реагентов, как сульфат меди, после смешивания снижаются примерно в 10 раз. Чтобы избежать их повреждающего воздействия на наночастицы вируса гепатита E, в качестве альтернативы можно использовать метод безмедной конъюгации.

Удалите несвязавшийся малеимидный клик-регент LXY30 с помощью спин-колонки для обессоливания согласно протоколу производителя. Храните наночастицы HEV, конъюгированные с LXY30, при температуре four degrees Celsius. Для проведения одностадийного конъюгирования наночастиц HEV LXY30 с флуоресцентной меткой Cy5.5 сначала смешайте наночастицы, связанные с LXY30, в концентрации one milligram per milliliter с равным объемом флуоресцентной метки Cy5.5 для получения молярного соотношения от one to five. После перемешивания смеси в течение ночи при температуре four degrees Celsius удалите несвязавшийся Cy5.5 NHS с помощью спин-колонки для обессоливания согласно протоколу производителя. Храните наночастицы HEV, конъюгированные с LXY30 и Cy5.5, при температуре four degrees Celsius.

Для функционализации наночастиц HEV пептидом LXY30 с целью таргетирования опухолевых клеток были опробованы два метода. В случае, когда наночастицы HEV 573C сначала связывали с малеимид-азидом, а затем проводили реакцию клик-химии с LXY30-алкином, при наблюдении с помощью ПЭМ наблюдался распад наночастиц HEV 573C. Однако предварительная реакция клик-химии между LXY30-алкином и малеимид-азидом с образованием LXY30, связанного с малеимидом, с последующим конъюгированием с модифицированными наночастицами HEV не повлияла на их структуру, и наночастицы HEV 573C остались целостными. Наночастицы HEV, связанные с LXY30 и Cy5.5, наносили на культивируемые клетки рака молочной железы и исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Изображения в ближнем инфракрасном диапазоне, полученные методом конфокальной микроскопии, указывают на то, что наночастицы HEV, связанные с LXY30 и Cy5.5, обладали более высоким сродством к связыванию, что привело к усилению интернализации в клетках рака молочной железы MDA MB-231 по сравнению с наночастицами HEV, связанными только с Cy5.5.

Значение данного метода распространяется на исследование мультимодальных таргетных и терапевтических молекул, которые позволяют осуществлять точное воздействие на опухоль и ее диагностику, не повреждая при этом нормальные клетки. Хотя этот метод позволяет получить представление о раке и адресной доставке в опухоль посредством химической модификации поверхности, он также может быть применен для ранней диагностики рака, скрининга и лечения под контролем визуализации.