Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать

Общая цель этих методов окрашивания заключается в количественной оценке внутриклеточного содержания липидов и оценке распределения липидов между различными тканями. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы липидного обмена, такие как как как генетически и биохимически регулируются липиды и какие заболевания регулируют липидный гомеостаз. Главное преимущество данной методики заключается в том, что она относительно проста и недорога в проведении.

Для проведения окрашивания липидов Nile Red пластинчатые черви на среде роста нематод или NGM засеяны поздней log OP50 E.coli и выращивают червей при температуре 20 градусов Цельсия до ранней стадии L4. Промойте червей одним миллиметром раствора PBST и переложите суспензию червей в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте черви при 560-кратном течении силы тяжести в течение одной минуты.

Затем удалите надосадочную жидкость и повторяйте промывку PBST до тех пор, пока кишечная палочка не будет очищена от суспензии. Далее к грануле червя добавьте 100 микролитров 40%-ного изопропанола или 60%-ного для окрашивания ОРО и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение трех минут. Добавление изопропанола имеет решающее значение для правильной пермеабилизации червей перед окрашиванием.

Центрифугируйте черви при 560-кратном течении силы тяжести в течение одной минуты и удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу червя. Важно свести к минимуму воздействие света на этапах центрифугирования. Теперь, находясь в темноте, добавьте в каждый образец по 600 микролитров предварительно приготовленного рабочего раствора NR.

Переверните трубки три раза и полностью перемешайте червей и раствор. Затем выдержите образец в темноте при комнатной температуре в течение двух часов. После инкубации центрифугируйте червей и удалите надосадочную жидкость.

Затем добавьте 600 микролитров PBST и инкубируйте образцы в темноте в течение 30 минут, чтобы удалить излишки NR пятна. После повторного вращения образцов, как и раньше, удалите все надсадочную жидкость, кроме примерно 50 микролитров, и снова суспендируйте гранулу червя в оставшемся растворе. Чтобы подготовить предметные стекла к визуализации, нанесите пипеткой пять микролитров суспензии червячной суспензии на предметное стекло микроскопа и осторожно наложите покровное стекло, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.

Используя канал FITC GFP для изображения червей, окрашенных NR и пробуя разное время экспозиции, можно получить изображение червей с пятикратным увеличением, чтобы захватить несколько животных в поле зрения. Затем переключитесь на 10-кратное увеличение для лучшего количественного определения отдельных червей. Чтобы количественно оценить изображения, загрузите микрофотографии в ImageJ.

В раскрывающемся меню изображений отрегулируйте яркость, контрастность массива изображений и распространите изменения на все изображения, нажав кнопку «Применить». Используйте инструмент выбора полигона для обозначения каждого изображенного червя, а в ниспадающем меню анализа используйте функцию измерения для определения интенсивности флуоресценции, излучаемой NR. Для каждого изображения измерьте пять фоновых местоположений и рассчитайте среднюю интенсивность фоновой флуоресценции. Добавьте 600 микролитров рабочего раствора Oil Red O или ORO в каждый образец и переверните пробирку три раза, чтобы хорошо перемешать черви и ORO.

Поворачивайте образцы со скоростью 30 об/мин и RT в течение двух часов. Центрифугируйте образцы при 560-кратной гравитации в течение одной минуты и аспирируйте всю надосадочную жидкость, за исключением 100 микролитров. Затем используйте 600 микролитров PBST для ресуспендирования образцов и вращайте пробирки со скоростью 30 об/мин в течение 30 минут, чтобы удалить излишки окрашивания ORO.

Чтобы лучше различить расположение зародышевой линии животных в клетках кишечника, окрашивайте ядра, добавляя один микролитр DAPI на каждый миллилитр рабочего раствора ORO. Затем подготовить предметные стекла для визуализации, повторно суспендировать червей и оставшуюся надосадочную жидкость и хорошо перемешать раствор. Нанесите пять микролитров суспензии червячной суспензии на предметное стекло микроскопа и осторожно наложите покровное стекло, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки воздуха.

Чтобы получить изображение окрашенных червей ORO, используйте цветную камеру с пятикратным увеличением, чтобы получить изображение нескольких червей в одном поле зрения. Затем переключитесь на 10-кратное увеличение для лучшего обследования отдельных червей. Наконец, после загрузки изображений в ImageJ и создания презентации изображений в соответствии с текстовым протоколом, распределите изображения по категориям в соответствии с накоплением липидов по всему телу животного или в определенных тканях.

SKN-1 имеет общую гомологию с Nrf2 млекопитающих и, как было показано, опосредует окисление жирных кислот. На этом рисунке показаны активированные животные СКН-1, подвергшиеся воздействию условий, которые приводят к повышению уровня липидов. Как видно на этих изображениях, флуоресценция NR, полученная с помощью канала FITC GFP, заметна вдоль кишечника, но тусклеена в голове, хвосте и просвете кишечника.

В то время как легко классифицировать червей в соответствии с наличием или отсутствием возрастного соматического истощения жира или ASDF, может быть трудно идентифицировать животных с промежуточной потерей жира. По сравнению с животными без ASDF, у которых наблюдается ярко-красное окрашивание по всему телу с небольшим количеством полупрозрачных областей, черви ASDF демонстрируют заметное истощение жира в клетках кишечника. У животных в процессе развития ASDF часто появляются полупрозрачные пятна, где в конечном итоге происходит большая часть потери жира.

Кроме того, черви ASDF могут по-прежнему иметь ярко-красное окрашивание в области головы и хвоста, потому что фенотип определяется не полной потерей соматического жира, а значительным истощением жира по сравнению с нестареющими животными. После освоения этой техники ее можно выполнить за три часа плюс время визуализации, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать мыть и протирать червей не более чем за 30 минут до окрашивания.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как микроскопия CARS, для сравнения типов липидов, которые идентифицирует каждая технология, и для определения того, какой метод лучше подходит для конкретных типов вопросов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно определить липиды и оценить распределение липидов в червях с помощью окрашивания Nile Red и Oil Red O, а затем провести анализ микрофотографий ImageJ.