Оценка коллаген и эластин схемотехнические зависящих от давления в артериях живой, человеческий сопротивления по микроскопии флуоресцирования Label бесплатно

Общей целью данной методики является обеспечение стандартизированной процедуры получения изображений живых артерий сопротивления человека для анализа взаимосвязи между микроархитектурой внеклеточного матрикса и механикой артериальной стенки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы сосудистой биологии и механики, такие как как давление вызывает изменения в общей геометрии, а также о микроархитектуре сосудистой стенки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что вам не нужно маркировать образец для визуализации.

Хотя этот метод может дать представление о механике артерии сопротивления, модифицированная версия протокола может быть применена к другим трубчатым органам, таким как бронхи, или к полоскам из человеческого мочевого пузыря или стенки кишечника. Для начала соберите интересующие образцы тканей сразу после их иссечения во время операции и подготовьте сосуды, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Надавите на канюлированную артерию до пяти миллиметров ртутного столба.

Затем настройте оптический путь для получения изображения, активировав двухфотонный лазер и установив длину волны возбуждения на 820 нанометров. Вставьте дихроичное зеркало длиной 460 нанометров, чтобы разделить свет излучения между фотоумножителями и собрать излучение одновременно в двух каналах. Используйте полосовые фильтры шириной от 30 до 60 нанометров с центром 520 нанометров для сбора автофлуоресценции эластина и еще один фильтр с центром 410 нанометров для сбора сигнала генерации второй гармоники коллагена.

Теперь установите время задержки лазера и пиксель на 10 микросекунд. Установите разрешение 512 на 512 пикселей для 100% поля зрения. Обеспечьте непрерывное сканирование и используйте как можно более низкую возбуждающую мощность света и время задержки пикселей, чтобы избежать фотоповреждения активной артерии.

Затем вручную просканируйте артерию, чтобы найти плоскость с максимальным диаметром. Затем выберите прямоугольный срез, охватывающий самый широкий диаметр артерии, и отсканируйте один кадр с размером пикселя 300 нанометров на пиксель или меньше. Сохраните это изображение для анализа позже.

Чтобы определить диаметр просвета и толщину стенки при максимальном диаметре артерии, сначала загрузите изображение на Фиджи. Установите масштаб, нажав на главное меню, а затем перейдите к анализу, а затем установите масштаб. Здесь введите микрометр на пиксель и соотношение пикселей.

Затем выберите инструмент «Линия Фиджи» и проведите линию между двумя внутренними эластичными пластинками по обе стороны от просвета артерии. Затем нажмите Control M, чтобы сообщить длину в таблице результатов. Продолжайте рисовать дополнительные линии, чтобы измерить толщину каждой стены, и сохраните окончательное измерение.

Перейдите на объектив с 60-кратным увеличением и числовой апертурой, равной единице или больше. Визуализируйте микроархитектуру коллагена и эластина на расстоянии пяти миллиметров ртутного столба, сканируя всю толщину артериальной стенки. Затем определите начальную и конечную глубину стека Z, а также расстояние между шагами Z и плотность пикселей.

При проектировании Z-стеков убедитесь, что область интереса достаточно мала, чтобы избежать вывода кривизны при последующем анализе. Когда все будет готово, настройте сохранение каждого канала отдельно. Наконец, найдите от одной до трех различных областей интереса и получите стеки 3D-изображений хорошего качества.

Если ваша эластиновая автофлуоресценция обесцвечивается, вы используете слишком высокую возбуждающую мощность света. Этого следует избегать. Чтобы завершить текущий эксперимент, вы можете добавить разбавленную концентрацию эозина для усиления автофлуоресценции эластина.

По завершении повторите весь процесс при давлении до 100 миллиметров ртутного столба, заменяя буфер в камере миографа свежим 37 градусами Цельсия HBS после каждого этапа давления. Чтобы начать анализ изображений, откройте стек изображений эластина на Фиджи. Затем перейдите к изображению, нажмите на стеки и выберите Z-проект, чтобы выбрать изображения для работы и выбрать максимальную интенсивность для типа проекции.

Сохраните проекцию максимальной интенсивности в виде изображения в формате TIFF. Затем выберите как можно больше точек разветвления внутренних эластичных волокон пластинки и измерьте их с помощью инструмента «Угол». Систематически проработайте каждое изображение, а когда закончите, сохраните лист результатов для Фиджи.

Чтобы измерить волнистость адвентициального коллагена, откройте стек изображений коллагена на Фиджи. Затем перейдите в раздел Изображение вниз к стекам и выберите Z-проект, чтобы выбрать изображения для работы и установить максимальную интенсивность проекции. Теперь измените тип изображения на восьмибитное изображение TIFF, щелкнув изображение, введите и затем восьмибитное.

Сохраните проекцию максимальной интенсивности в виде изображения в формате TIFF. Откройте плагин Neuron J, нажав на Фиджи и выбрав Neuron J в разделе плагинов. Затем откройте восьмибитный файл TIFF в Neuron J. После открытия нажмите на «Добавить трассировки» и выберите волокна для анализа, нажав на начало и конец каждого волокна.

Затем перейдите к измерениям трассировок и выберите в диалоговом окне Отображать трассировку и измерения вершин. Чтобы рассчитать прямолинейность волокна коллажа, сначала скопируйте значения в окне трассировки Фиджи в Excel. Значения длины в окне трассировки являются мерами полной длины анализируемых коллагеновых волокон Lf.Во-вторых, копия для каждого анализируемого пучка коллагеновых волокон первой и последней координат XY окна вершин Фиджи в Excel.

Затем рассчитайте длину прямой линии, соединяющей каждый конец анализируемого коллагенового волокна L0, используя теорему Пифагора. Прямолинейность коллагеновых волокон рассчитывается как L0/Lf. Следуя только что показанному протоколу, была определена самая широкая часть артерии, и на этом этапе артерия была отсканирована с помощью флуоресцентной микроскопии без меток для измерения максимального диаметра сосуда и толщины стенки сосуда.

Используя объектив с большим увеличением до большой числовой апертуры, можно измерить не только диаметр сосуда и толщину стенки, но и микроархитектуру коллагена и эластина. Микроархитектура эластинового волокна, углы ветвления и прямолинейность коллагена могут быть определены в последовательных срезах изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений. Это позволяет провести прямой анализ взаимосвязи между индуцированными давлением изменениями в микроархитектурах коллагена и эластина и инкрементальным модулем упругости при различных давлениях.

После этой процедуры из изображений можно извлечь и другую информацию. Это могут быть ангелы ориентации адвентициального коллагена вдоль продольной оси сосуда или это может быть микроархитектура внеклеточного матрикса в среде оболочки. Количественные показатели, извлеченные из изображений с помощью этого метода, могут быть введены в математические модели, чтобы выяснить, как здоровый и умерший кровообращение человека реагирует на различные условия.

После просмотра этого видео вы должны иметь полное представление о том, как планировать свои эксперименты по визуализации и последующему анализу изображений, чтобы извлечь информацию о том, как давление вызывает изменения в микроархитектуре стенки артерии сопротивления. Помните, что при работе с флуоресцентной микроскопией с двухфотонным возбуждением необходимо избегать любого воздействия видимого и невидимого света.