Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани
25 августа 2018 г.
Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.
Общая цель этого видео — представить новый простой метод выделения и культивирования первичных клеток эпидермиса человека из ткани кожи взрослого человека. Этот передовой метод больше подходит для получения большого количества высокопотенциальных эпидермальных клеток как для лабораторного, так и для клинического применения. Промойте салфетку PBS перед взвешиванием.
Взвесьте кожную ткань с помощью электронных весов. Промойте ткань кожи с 70% этанолом в течение 30 секунд. Инкубируйте ткань в PBS с антибиотиками дважды по пять минут каждый раз.
Переложите ткань в другую стерильную посуду и тщательно гомогенизируйте с помощью лезвий скальпеля. Добавляйте 200 микролитров PBS каждые пять минут, чтобы сохранить ткань влажной. Переложите гомогенизированную ткань в трубку объемом 50 миллилитров.
Добавьте 10 миллилитров ферментной смеси на каждый грамм кожной ткани. Тщательно смешайте ферменты с гомогенизированными тканями. Выдержать смесь на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием.
После этого добавьте 1/5 объема 0,25%трипсина. Продолжайте инкубацию в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте в смесь раствор Dnase I в соотношении один к 100.
Затем высиживайте еще пять минут. Остановите процесс пищеварения, добавив такой же объем нейтрализующей среды. Подавайте раствор пипеткой вверх и вниз около 20 раз.
Отфильтруйте диссоциированные клетки через клеточный фильтр 100 микрометров, чтобы удалить остатки ткани. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Следите за гранулой на дне трубки.
Удалите надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу 10 миллилитрами нейтрализующей среды. Затем центрифугировать при 200 г в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в инокуляционной среде с 10 микромолярным ингибитором ROCK.
Поместите два раза по 10 на шестую клетку в 100-миллиметровую чашку для культивирования. Через три дня замените среду для посева на бессывороточную кератиноцитарную среду. Меняйте среду каждые два дня.
Когда клетки достигнут примерно 80% плотности, пропустите клетки. Промойте клетки с помощью PBS. При необходимости трипсинизируйте в течение двух минут и промойте клетки PBS для удаления загрязненных дермальных клеток.
Добавьте такой же объем нейтрализующей среды. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Наконец, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте клеточную гранулу.
Выделенные кератиноциты из тканей кожи человека инкубировали отдельно двумя методами. Традиционный метод представляет собой двухэтапное пищеварение, которое включает в себя двухдневную процедуру. В отличие от этого, новый метод представляет собой одноэтапное разложение, которое занимает около трех часов.
На третий день мы можем легко найти множество клеточных кластеров, культивируемых новым методом, в то время как при использовании традиционного метода этого явления не происходит. На пятый день было замечено, что новый метод производит большее количество первичных клеток. Для проверки статуса дифференцировки культивируемых кератиноцитов мы проанализировали базальный клеточный маркер К5 и терминальный маркер дифференцировки лорикрин.
Мы обнаружили, что 90% от общего числа клеток были K5-положительными, но менее 10% клеток экспрессировали лорикрин на третьем пассаже, что указывает на то, что они являются недифференцированными кератиноцитами. Мы проверили экспрессию виментина, который экспрессируется в дермальном фибробласте, чтобы изучить загрязнение дермальных клеток во время выделения. Мы обнаружили, что около 3% дермальных клеток появились в первоначальном пассаже, но только около 0,02% дермальных клеток были обнаружены в третьем пассаже, что указывает на высокую чистоту эпидермальных клеток после пассажа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен упрощенный протокол выделения первичных кератиноцитов человека из тканей кожи взрослого человека. В методе используется ингибитор ROCK Y-27632 для облегчения отделения эпидермальных клеток от дермальных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Дерматология
- Регенеративная медицина
Теоретические основы
- Первичные кератиноциты человека имеют важное значение для различных направлений исследований.
- Традиционные методы выделения могут быть сложными и трудоемкими.
- Использование ингибитора ROCK Y-27632 обеспечивает более эффективный подход.
- Выделенные кератиноциты могут быть использованы как в лабораторных, так и в клинических условиях.
Цель исследования
- Разработать более эффективный метод изоляции эпидермальных клеток.
- Увеличить выход эпидермальных клеток с высоким потенциалом.
- Облегчить проведение исследований и клиническое применение с использованием клеток кожи.
Используемые методы
- Промойте ткань кожи в PBS перед взвешиванием.
- Взвесьте ткань кожи с помощью электронных весов.
- Промойте ткань в 70% этаноле в течение 30 секунд.
- Дважды инкубируйте ткань в PBS с антибиотиками по пять минут каждый раз.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно выделить первичные кератиноциты.
- Были получены высокие выходы жизнеспособных эпидермальных клеток.
- Метод является воспроизводимым и эффективным.
- Выделенные клетки могут быть использованы для различных целей.
Выводы
- Данный метод упрощает выделение первичных кератиноцитов.
- Он представляет собой надежный подход для исследователей в данной области.
- Использование ингибитора ROCK повышает выход и жизнеспособность клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Выделение высокочистых первичных кератиноцитов кожи человека из образцов взрослых пациентов остается проблемным этапом в исследованиях и разработках в области дерматологии и регенеративной медицины из-за низкого выхода клеток и рисков контаминации. Данный упрощенный одноэтапный ферментативный метод с использованием ингибитора ROCK Y-27632 улучшает восстановление эпидермальных клеток и сохранение их стволовых свойств, что позволяет масштабировать производство для валидации мишеней и доклинического моделирования. Такой подход снижает сложность и временные затраты на проведение процедуры, способствуя воспроизводимости разработки анализов и обеспечивая трансляционную непрерывность от этапа открытия до оптимизации соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать сигнальные пути эпидермиса и взаимодействие с мишенями в физиологически релевантной системе клеток человека.
- Практическая ценность: обеспечивает возобновляемый источник первичных кератиноцитов с высокой степенью чистоты K5+/Loricrin- для последовательного снижения рисков при работе с мишенями.
- Прогностическая ценность: способствует механистическому снижению рисков за счет сохранения характеристик стволовых клеток и низкого уровня загрязнения фибробластами (<0.02% на P3), что обеспечивает надежный скрининг фенотипа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет получать большое количество жизнеспособных эпидермальных клеток, подходящих для высокопроизводительного скрининга соединений и тестирования цитотоксичности.
- Стандартизация: одноэтапный протокол переваривания (~3 часа) повышает воспроизводимость результатов между различными партиями и лабораториями.
- Масштабируемость: исключает необходимость разделения эпидермиса и дермы, что позволяет применять метод к различным тканям взрослых особей и увеличивает пропускную способность при кампаниях по поиску ведущих соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Позволяет получать кератиноциты со свойствами стволовых клеток, которые моделируют гомеостаз и барьерную функцию эпидермиса человека.
- Трансляционная преемственность: Сохраняет фенотипическую стабильность при пассировании, что обеспечивает возможность проведения доклинических испытаний эффективности и безопасности.
- Оптимизация прогресса с учетом рисков: Высокая степень чистоты и выход продукта снижают биологическую вариабельность, что повышает уверенность в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки кандидатов для местного применения или регенеративной терапии.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум научных открытий, предоставляя валидированные первичные кератиноциты человека для ранней валидации мишеней, обеспечивая разработку анализов для скрининговых кампаний и поддерживая доклиническую оценку дерматологических терапевтических средств.
- Открывательная биология: облегчает проверку гипотез на эпидермальных мишенях с использованием очищенной системы человеческих клеток, обогащенной стволовыми клетками.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных количественных клеточных препаратов для анализа зависимости «доза-эффект» и определения биомаркеров при оценке соединений.
- Аналитика: позволяет измерять маркеры дифференцировки (K5, Loricrin) и уровни загрязнения (vimentin) для оценки клеточного фенотипа и чистоты.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от изолированных первичных клеток к доклиническим моделям за счет сохранения стволовых свойств и функциональности эпидермиса.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу изоляции, применимую в нескольких проектах, требующих использования эпидермальных клеток человека.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет получения высокочистых кератиноцитов, обогащенных стволовыми клетками.
- Операционная ценность: сокращает время изоляции с двух суток до ~3 часов, что увеличивает пропускную способность лаборатории и эффективность использования ресурсов.
- Стратегическая ценность: повышает точность прогнозов на ранних этапах программ за счет минимизации биологического шума, вызванного загрязнением дермальными клетками.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе надежных анализов с использованием эпидермальных клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами клеток и методами ферментативной диссоциации тканей.
- Необходим доступ к ингибитору ROCK Y-27632, смесям ферментов (например, диспазе, трипсину) и ДНКазе I для переваривания.
- Требуется соблюдение стандартов центрифугирования, фильтрации и правил стерильной работы для поддержания жизнеспособности и чистоты клеток.
- Необходима адаптация составов сред для инокуляции и культивирования кератиноцитов для обеспечения оптимальной экспансии и пассирования.
- Практические ограничения включают вариабельность качества кожного тканевого материала доноров и необходимость асептического обращения для предотвращения микробиологического загрязнения.
