Вынуждены слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции комаров
7 августа 2018 г.
Для эффективного контроля комаров несут передачи вируса знание Векторный потенциал соответствующих комаров представляет особый интерес. Мы описываем принудительного слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции Aedes albopictus и три различных таксонов Culex для передачи вируса Зика.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области болезней, переносимых комарами, например, является ли вид комаров компетентным переносчиком определенного вируса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что большое количество комаров можно анализировать одновременно, без использования лабораторных животных, таких как мыши. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что он требует навыков мелкой моторики, которые можно приобрести только через практику.
Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, так как ключевые шаги сложны для изучения; Они требуют опыта работы с комарами и вирусами, а также мелкой моторики. Для начала разведите вирусный запас. Затем смешайте просроченную человеческую кровь с фруктозой, отфильтрованной бычьей сывороткой и вирусным запасом.
Заморозьте 140 микролитров смеси кровяной муки для дальнейшего анализа с помощью TCID50. Далее положите две капли смеси для кровяной муки по 50 микролитров в пластиковый флакон и дайте комарам покормиться в течение двух часов. После обезболивания комаров подсчитайте полностью набухших особей и переложите их в новый флакон, содержащий ватный диск, смоченный во фруктозе.
Затем поддерживайте комаров при температуре 27 градусов по Цельсию и влажности 80% в течение 14 или 21 дня. Пополняйте насыщенные фруктозой ватные диски каждые 72 часа 1,5 миллилитрами фруктозы. Сначала засейте 20 000 клеток Vero в лунку в 96-луночный планшет с добавленной питательной средой.
Чтобы приготовить устройство для слюноотделения, поставьте на скамью квадратную стеклянную пластину под углом 30 градусов. Затем приклейте двусторонний скотч к верхней части стеклянной пластины. Далее раскатайте пластилин до его диаметра 0,5 сантиметра, и приложите его к плите горизонтально на расстоянии одного сантиметра от двустороннего скотча.
Отрежьте наконечники от необходимого количества 10-микролитровых фильтрующих наконечников и заполните каждый наконечник 10 микролитрами PBS. Затем поместите кончики на пластилин и закрепите их с легким нажимом. Далее обездвижите комаров, удалив им ноги и крылья.
Закрепите комаров на ленте над наконечниками фильтров. Аккуратно поместите хоботок каждого комара в наконечник фильтра. Через 30 минут снимите наконечники фильтра, а глину и скотч выбросьте.
Переложите собранную слюну в реакционные пробирки, содержащие 10 микролитров PBS. Осторожно смешайте слюну и PBS и переложите смесь в лунки 96-луночной пластины. Инкубируйте тарелку в течение семи дней при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.
С помощью светового микроскопа проверяют клетки на наличие цитопатического эффекта. Как только лунка станет положительной на цитопатический эффект, используйте пипетку для сбора 140 микролитров надосадочной жидкости. Затем перенесите надосадочную жидкость в реакционную трубку.
Далее смешайте 140 микролитров надосадочной жидкости с 560 микролитрами буфера AVL, и выдержите в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, добавьте 560 микролитров этанола и переверните образец для перемешивания. Используя этот протокол, несколько видов комаров были протестированы на инфекцию вируса Зика и передачу в различных климатических условиях.
При температуре 27 градусов Цельсия при температуре инкубации у всех видов Aedes наблюдалась слюна, положительная на вирус Зика. И наоборот, ни один из образцов слюны таксонов Culex не содержал доказательств вируса. После освоения этой техники ее можно выполнить для 50 комаров за один час при правильном выполнении.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты с принудительным слюноотделением. Не забывайте, что работа с инфицированными комарами может быть очень опасной, поэтому при проведении любого эксперимента всегда следует соблюдать специальные меры безопасности при обращении с комарами в условиях BSA-3.
Обзор
В данной статье рассматривается метод анализа векторной компетенции комаров, в частности Aedes albopictus и различных таксонов Culex, в отношении передачи вируса Zika. Метод принудительной саливации позволяет проводить одновременный анализ нескольких особей комаров без использования лабораторных животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология переносчиков
- Вирусология
- Трансмиссивные заболевания, переносимые комарами
Теоретические основы
- Понимание векторной компетенции имеет решающее значение для контроля вирусов, передающихся комарами.
- Принудительная саливация представляет собой новый метод оценки трансмиссивного потенциала комаров.
- Предыдущие методы часто требовали использования лабораторных животных, что данный метод позволяет исключить.
- Для применения этого метода необходимы развитые навыки мелкой моторики, что требует практики и опыта.
Цель исследования
- Оценить векторную компетенцию различных видов комаров по отношению к вирусу Zika.
- Продемонстрировать метод, позволяющий проводить высокопроизводительный анализ слюны комаров.
- Представить визуальное руководство для исследователей, впервые использующих данную методику.
Используемые методы
- Приготовление смеси крови для кормления комаров.
- Метод принудительного слюноотделения для сбора слюны комаров.
- Методы культуры клеток для оценки наличия вируса Зика.
- Инкубация и анализ образцов на наличие цитопатических эффектов.
Основные результаты
- Виды Aedes показали наличие вируса Zika в слюне в контролируемых условиях.
- У таксонов Culex признаков наличия вируса Zika в слюне обнаружено не было.
- После освоения метода можно тестировать до 50 комаров за один час.
- Визуальные демонстрации значительно облегчают изучение данной методики.
Выводы
- Принудительная саливация является эффективным методом изучения передачи вирусов, переносимых комарами.
- Обучение и практика необходимы для успешного внедрения данной методики.
- При работе с инфицированными комарами необходимо строго соблюдать меры безопасности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Методы принудительной саливации позволяют проводить высокопроизводительную оценку векторной компетенции комаров без использования животных моделей, что способствует валидации мишеней на ранних стадиях поиска противовирусных препаратов. Данный метод обеспечивает количественное обнаружение репликативно-компетентного вируса у отдельных особей насекомых, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки профилактических или терапевтических кандидатов против арбовирусов. Масштабируемость и воспроизводимость метода повышают прогностическую достоверность при доклинической оценке рисков вмешательств, направленных на блокирование передачи вируса.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Научная ценность: проверка терапевтических гипотез путем измерения потенциала передачи вируса отдельными переносчиками заболевания.
- Операционная ценность: возможность биологического снижения рисков при выборе мишеней за счет прямой оценки компетентности переносчиков в контролируемых условиях.
- Прогностическая ценность: поддержка приоритизации портфеля за счет выявления некомпетентных видов переносчиков, что сокращает количество ложноположительных результатов в программах по изучению арбовирусов.
Скрининг и разработка метода анализа
- Научная ценность: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующего противовирусного скрининга путем подтверждения восприимчивости к вирусу в моделях переносчиков.
- Практическая ценность: стандартизирует сбор слюны и определение вируса, обеспечивая воспроизводимые количественные результаты для больших когорт комаров.
- Масштабируемость: позволяет повторно использовать платформу для высокопроизводительной оценки соединений или вакцин, блокирующих передачу вируса.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствие системам, релевантным заболеванию, за счет тестирования векторной компетенции при эпидемиологически значимых температурах (18–27°C).
- Практическая ценность: Обеспечение непрерывности процесса от этапа открытия до доклинической валидации посредством последовательного анализа содержания вируса в слюне.
- Снижение рисков: Обоснование решений о дальнейшем продвижении разработок путем установления температурных порогов передачи для ведущих кандидатов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод принудительной саливации вписывается в континуум исследований от валидации мишени через идентификацию ведущих соединений до доклинической оценки, что особенно актуально для разработки мер противодействия арбовирусам.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи путем количественного определения наличия вируса в слюне комаров в качестве функционального показателя потенциала трансмиссии.
- Скрининг: Обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа за счет стандартизированного сбора слюны и определения вируса в клетках Vero по эквиваленту TCID50.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (вирусный титр в слюне), что делает возможным сравнение различных видов, штаммов и условий окружающей среды.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет данных о передаче, стратифицированных по температуре, которые отражают релевантные для полевых условий окна трансмиссии.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемым методом для скрининга нескольких арбовирусов (например, ZIKV, DENV, CHIKV) на различных видах переносчиков без необходимости повторной оптимизации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности при валидации мишеней, снижение механистической неоднозначности в биологии передачи.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость в работе групп энтомологов и вирусологов.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок, эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах противовирусных программ.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе эмпирических данных о векторной компетенции.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области работы с комарами, вирусологии и микрохирургических методов в условиях уровня биобезопасности BSL-3.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая устройства для стимуляции слюноотделения, инкубаторы с точным контролем влажности и микроскопию для оценки цитопатического эффекта.
- Необходима межкомандная стандартизация приготовления питательной кровяной смеси, графиков инкубации и интервалов сбора слюны.
- При адаптации метода следует учитывать видоспецифичный размер хоботка, особенности питания и морфологию слюнных желез различных моделей переносчиков.
- Практические ограничения включают необходимость длительного обучения для достижения необходимого уровня мастерства, а также зависимость метода от возможности выделения жизнеспособного вируса из слюны.
