Изоляция и определение внесосудистой иммунных клеток сердца
23 августа 2018 г.
Этот протокол предоставляет простой и эффективный метод, чтобы изолировать, выявлять и количественно иммунные клетки, проживающих в миокарде мышей при установившемся или воспаления. Протокол сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение для поколения подвеска одну ячейку, которая может быть далее проанализирован подачей cytometry.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о составе субпопуляций иммунных клеток в сердце как в стационарном, так и в болезненном состоянии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для точного иммунофенотипирования популяций сердечных иммунных клеток, включая очень редкие субпопуляции. Этот протокол относительно прост.
Тем не менее, инъекции в хвостовую вену могут быть сложными, поэтому важно практиковать эту технику, пока вы не почувствуете себя комфортно, прежде чем использовать экспериментальных животных. Чтобы пометить циркулирующие лейкоциты, загрузите 200 микролитров свежеприготовленного мышиного флуорофор-конъюгированного анти-CD45 антитела в PBS в инсулиновый шприц 28,5-го калибра и предварительно разогрейте восемь 12-недельных мышей на циркулирующем водяном одеяле, установленном до 35-41 градуса Цельсия, в течение 5-10 минут. Когда хвостовая вена расширилась, зафиксируйте первое животное в кормовом положении в соответствующем удерживающем устройстве.
Если хвостовые вены недостаточно расширены, окуните хвост в воду с температурой от 36 до 40 градусов Цельсия на одну-две минуты. Когда хвостовые вены будут готовы, проведите мазок с места инъекции марлей, пропитанной на 70% этанолом, и иммобилизуйте основание хвоста указательным и средним пальцами и среднедистальную область хвоста большим и безымянным пальцами. Держа иглу скошенной стороной вверх и параллельно вене, введите иглу в расширенную хвостовую вену и внутривенно введите весь объем антитела.
Затем дайте антителу циркулировать в течение пяти минут перед гуманной эвтаназией. Чтобы извлечь сердце, распылите на мышь 70% этанола и приподнимите кожу живота, чтобы открыть брюшную полость вдоль вентральной средней линии от бедер до грудины. Откройте брюшину и сдвиньте печень, чтобы обнажить диафрагму.
Разрежьте диафрагму и ребра по обе стороны от средней линии, стараясь не проколоть легкие и сердце. Снимите ребра, чтобы обнажить сердце, прежде чем надрезать левое и правое предсердия. Осторожно захватив основание сердца щипцами, введите иглу 21-го калибра, прикрепленную к 60-миллилитровому шприцу, в левый желудочек возле верхушки и перфузируйте сердце от 15 до 20 миллилитров холодного PBS.
Правильная перфузия сердца имеет важное значение для предотвращения внутрисосудистых загрязнений. Поэтому позаботьтесь о том, чтобы вскрыть и перфузировать сердце сразу после эвтаназии, чтобы избежать загрязнения из-за свернувшейся крови. После перфузии правого желудочка, как показано выше, следует наблюдать белые легкие и бледную печень.
Удерживая основание сердца щипцами, осторожно подтяните сердце вверх и разрежьте основные легочные артерии и вены, аорту и перикардиальный мешок, чтобы отделить сердечную ткань. Аккуратно удерживая сердце между большим и указательным пальцами, тщательно очистите сердце чистым безворсовым бумажным полотенцем и с помощью щипцов удалите предсердия и любые остатки любых крупных артерий и вен или других загрязнений. Поместите очищенное сердце в пятисантиметровую пластиковую посуду и добавьте 50 микролитров холодного ПБС.
С помощью изогнутых ножниц для препарирования измельчите сердцевину до тех пор, пока не останется видимых кусочков и ткань не приобретет гладкую густую консистенцию. С помощью изогнутых щипцов перенесите ткань в двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие 800 микролитров холодного DMEM. Принимайте добавки с коллагеназой, ДНКазой и гиалуронидазой и инкубируйте в течение 45–60 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 50 оборотах в минуту.
По окончании переваривания переваривайте образцы в течение 20 секунд и сразу же помещайте их на лед. Образец всегда следует хранить при температуре четыре градуса Цельсия, если не указано иное, так как некоторые поверхностные антигены могут быть интернализованы, если оставить их при комнатной температуре. Затем предварительно намочите 140-микролитровое сетчатое фильтр в 50-миллилитровой конической пробирке на образец с одним миллилитром холодного ГБВ.
С помощью пипетки объемом один миллилитр пипетируйте образцы до тех пор, пока тканевые суспензии не станут однородными и не забьют наконечник пипетки, и добавьте гомогенизированные образцы в фильтры. Медленно промойте образцы через фильтры с 12-14 миллилитрами холодного ГБД на образец и переложите отфильтрованные образцы в маркированную 15-миллилитровую коническую пробирку со льдом. О хорошем пищеварении свидетельствует отсутствие сердечных остатков в фильтре.
Соберите образцы методом центрифугирования и удалите надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр буфера для лизиса калия хлорида аммония в каждый образец. Повторная суспендия образцов с кратковременным вортексированием с последующей пятиминутной инкубацией при комнатной температуре.
Затем прекращают гемолиз пятью-восемью миллилитрами холодного HBSS. Соберите образцы методом центрифугирования и повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре флуоресцентно-активируемой сортировки клеток или буфере FACS и переложите в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра для еще одного центрифугирования. Для анализа образцов методом проточной цитометрии ресуспендировали гранулы в 50 мкл анти-CD16/CD32 антител и блокатора моноцитов для снижения связывания неспецифических антител в течение 15-минутной инкубации при комнатной температуре.
Не промывая, добавьте в каждый образец по 50 микролитров мастер-смеси антител при перемешивании для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте. В конце инкубации промойте образцы 600 микролитрами буфера FACS на пробирку и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах свежего буфера FACS или 1% параформальдегида. Затем анализируют сердечные лейкоциты методом проточной цитометрии в соответствии со стандартными протоколами проточного анализа.
Анализ суспензии сердечных одиночных клеток с помощью проточной цитометрии требует предварительного гейтирования CD45 для дифференцировки иммунных клеток от неиммунных клеток сердца с последующим газоблокированием одиночных клеток и малых размеров. Макрофаги, идентифицируемые по экспрессии CD64, являются основной популяцией иммунных клеток сердца, представляя от 60 до 70% всех иммунных клеток. Обычные сердечные дендритные клетки представляют собой CD64-отрицательные клетки, которые экспрессируют высокие уровни MHC класса II и CD11c.
Эти клетки могут быть дополнительно разделены на основе их экспрессии CD103 или CD11b и представляют собой гораздо меньшую сердечную субпопуляцию по сравнению с макрофагами. Использование проточной цитометрии одноклеточной суспензии миокарда позволяет изучать небольшие субпопуляции лейкоцитов в сердце. Например, используя анализ проточной цитометрии для сравнения иммунных клеток миокарда дикого типа с мышами с дефицитом Batf3, можно подтвердить отсутствие CD103-положительных дендритных клеток у нокаутированных животных.
Кроме того, этот анализ выявил отсутствие существенных изменений состава других сердечных популяций у животных с дефицитом Batf3, демонстрируя степень чувствительности, которая может быть достигнута с помощью этого комбинированного метода ферментативного и механического пищеварения для получения суспензии одной клетки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно всегда учитывать жизнеспособность вашего клеточного изолята. Поэтому мы рекомендуем оптимизировать время и концентрацию ферментов в пищеварении в соответствии с условиями вашего эксперимента.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование РНК одиночных клеток, функциональные анализы и выделение магнитных шариков, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функциях выделенных клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен простой и эффективный метод выделения, идентификации и количественного анализа иммунных клеток, находящихся в миокарде мышей в состоянии покоя или при воспалении. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о составе субпопуляций иммунных клеток в сердце как в норме, так и при патологических состояниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Кардиология
- Проточная цитометрия
Теоретические основы
- Сердце содержит различные популяции иммунных клеток.
- Понимание этих популяций имеет решающее значение для здоровья сердца.
- Точное иммунофенотипирование необходимо для изучения редких подмножеств иммунных клеток.
- Инъекции в хвостовую вену являются распространенным методом маркировки циркулирующих лейкоцитов.
Цель исследования
- Изолировать и количественно определить иммунные клетки в миокарде.
- Проанализировать подмножества иммунных клеток при различных физиологических состояниях.
- Усовершенствовать методы изучения иммунного ответа сердца.
Используемые методы
- Ферментативное и механическое расщепление для получения суспензии одиночных клеток.
- Проточная цитометрия для анализа популяций иммунных клеток.
- Инъекции конъюгированных с флуорофором антител к CD45 в хвостовую вену.
- Предварительный прогрев мышей для облегчения доступа к хвостовой вене.
Основные результаты
- Успешное выделение иммунных клеток из миокарда мыши.
- Идентификация различных популяций иммунных клеток.
- Демонстрация эффективности метода как в состоянии покоя, так и при воспалении.
- Подчеркивание важности практики для успешного выполнения инъекций в хвостовую вену.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения иммунных клеток сердца.
- Он углубляет понимание иммунных ответов в сердце.
- Этот метод доступен для исследователей, прошедших соответствующее обучение.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точное профилирование субпопуляций иммунных клеток сердца позволяет снизить механистические риски при валидации сердечно-сосудистых мишеней, проясняя воспалительные пути и иммуноопосредованные механизмы действия. Данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, предоставляя количественные, воспроизводимые данные иммунофенотипирования, которые служат основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) на ранних этапах поиска. Описанный подход восполняет критический пробел в изучении редких, но функционально значимых популяций иммунных клеток в условиях гомеостаза, что повышает трансляционную значимость программ в области иммунокардиологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного анализа состава иммунных клеток и их функциональной компартментализации в миокарде.
- Практическая ценность: обеспечивает надежный метод дифференциации истинных сигналов резидентных иммунных клеток ткани от внутрисосудистого загрязнения, что повышает достоверность данных.
- Стратегическая ценность: способствует снижению рисков при выборе мишеней благодаря точной идентификации подмножеств макрофагов и дендритных клеток, участвующих в воспалении и фиброзе сердца.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированную суспензию единичных клеток, подходящую для многопараметрического анализа методом проточной цитометрии, что обеспечивает согласованность иммунофенотипирования в разных экспериментах.
- Практическая ценность: Сочетает ферментативную и механическую диссоциацию с маркированием сосудов для достижения высокой жизнеспособности и чистоты клеток, что снижает вариабельность анализа.
- Стратегическая ценность: Создает воспроизводимый рабочий процесс изоляции иммунных клеток, который может быть адаптирован для различных моделей заболеваний и кампаний по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает возможность лонгитюдного иммунного мониторинга от стационарного состояния до воспалительных процессов, что способствует поиску биомаркеров и пониманию механизмов развития заболевания.
- Операционная ценность: Полученные результаты совместимы с последующими методами анализа, такими как сортировка FACS, сепарация с помощью магнитных частиц и секвенирование РНК единичных клеток для функциональной валидации.
- Стратегическая ценность: Позволяет снизить риски при дальнейшем развитии исследований путем подтверждения связывания с мишенью и иммунной модуляции на соответствующих доклинических моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска новых соединений — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, предоставляя данные иммунного профилирования, которые позволяют определить механизм действия и оценить безопасность при разработке сердечно-сосудистых лекарственных препаратов.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы путем количественного определения ключевых иммунных подмножеств в сердце, таких как CD64+ макрофаги и CD11c+ MHC-IIhi дендритные клетки.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных суспензий одиночных клеток, готовых к проточной цитометрии, что позволяет сравнивать иммунный состав при различных генетических или фармакологических условиях.
- Аналитика: позволяет определять многопараметрические иммунные фенотипы (например, соотношение CD103+ и CD11b+ дендритных клеток), что помогает снизить риски при выборе мишеней за счет выявления специфических ответов отдельных подмножеств.
- Трансляционные исследования: связывают динамику иммунных клеток с прогрессированием заболевания, что способствует согласованию биомаркеров в моделях воспаления и ремоделирования миокарда.
- Корпоративное повторное использование: основная стратегия изоляции и маркировки применима к другим органам и областям патологии, что способствует стандартизации между различными платформами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, обеспечивая уверенную идентификацию редких иммунных субпопуляций, которые определяют патофизиологию сердца.
- Операционная ценность: Стандартизирует выделение иммунных клеток за счет четко определенного ферментативного переваривания, маркировки сосудов и стратегий гейтирования при проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует приоритизацию портфеля, предоставляя данные об иммуноопосредованных механизмах, которые лежат в основе стратегий комбинированной терапии и стратификации пациентов.
- Влияние на портфель: Поддерживает принятие решений с учетом рисков за счет воспроизводимого количественного определения изменений иммунных клеток в доклинических исследованиях эффективности и безопасности.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с мышами, владение техникой инъекций в хвостовую вену и навыками асептического выделения тканей для обеспечения качества образцов.
- Зависит от наличия оборудования для проточной цитометрии, конъюгированных с флуорохромами антител и ферментативных реагентов (коллагеназы, гиалуронидазы, ДНКазы).
- Необходима стандартизация времени перфузии, дигестии и лизиса для всех операторов с целью минимизации вариабельности выхода и жизнеспособности иммунных клеток.
- Требуется оптимизация концентрации ферментов и времени инкубации в зависимости от размера сердца, возраста и состояния заболевания для сохранения целостности эпитопов.
- Ограничено необходимостью немедленной обработки образцов после эксцизии для предотвращения интернализации поверхностных антигенов и сохранения точности окрашивания.
