Этикетка свободной идентификации лимфоцитов подтипы, с использованием трехмерных количественных этап визуализации и машинного обучения
19 ноября 2018 г.
Мы описываем протокол для лейбл свободной идентификации подтипы лимфоцитов с помощью количественных этап визуализации и алгоритм машинного обучения. Измерение 3D преломления томограмм лимфоцитов представляют 3D Морфологические и биохимические информации для отдельных ячеек, который затем анализируется с помощью алгоритмов машинного обучения для идентификации типов клеток.
Этот метод является альтернативой обычной процедуре маркировки флуоресценции и цитометрии потока, которые относят много времени, дорого и несут на себя риск изменения клеточной функции образцов. Основным преимуществом этого метода является трехмерная рефракционная индексная томография и машинное обучение без маркировки и количественные методы, позволяющие быстро и точно идентифицировать лимфоциты. Последствия этого метода распространяются на терапию рака крови и аутоиммунных заболеваний, как выявление лимфоцитов может иметь решающее значение для диагностики заболеваний и соответствующего применения лечения.
Хотя этот метод может обеспечить понимание популяций лимфоцитов, он также может быть применен к анализу других отдельных клеток, представляющих интерес, в том числе бактерий. Визуальная демонстрация технологии 3D количественной фазовой визуализации имеет решающее значение, поскольку она облегчает четкую инструкцию о том, как выполнить технику и может дать представление о ее применении. Начните с сбора каждого подмножества лимфоцитов путем флуоресценции активированной сортировки клеток.
Для оптимальной визуализации разбавляют каждый образец клетки концентрацией 180 клеток на микролитер среды RPMI и медленно впрыскивают 120 микролитров первого разбавленного образца в камеру визуализации. Подтвердив отсутствие пузырьков в камере, поместите каплю дистиллированной воды на объектив объективного 3D-количественного фазового микроскопа и поместите камеру визуализации на стадию перевода микроскопа. Отрегулируйте этап так, чтобы образец согласовыван с объективом цели, и нажмите фокус и поверхность в вкладке калибровки микроскопа перспективы программного обеспечения изображения для регулировки ося позиции объективов цели и конденсатора, соответственно.
Нажмите режим Auto, чтобы выровнять объективы цели и конденсатор. Для оптимизации выравнивания откройте режим сканирования и вручную отрегулируйте линзы, чтобы выровнять цифровой шаблон микромиррора устройства к центру. Затем вернитесь в нормальный режим и отрегулируйте этап перевода, чтобы найти ячейку в поле зрения.
Отрегулируйте осяное положение объектива, чтобы найти фокусную плоскость до тех пор, пока граница образца, визуализирована на экране, не будет почти невидимой. Важно идеально настроить фокус ячейки для создания оптимальной томограммы 3DRI. Если изображение не будет сделано должным образом, 3D-реконструкция будет нарушена, что приведет к шумной томограмме.
Отрегулируйте этап перевода, чтобы найти место без ячейки и нажмите Calibrate, чтобы измерить несколько 2D голограмм с различными углами освещения. Отрегулируйте этап перевода, чтобы найти ячейку в центре поля зрения. И под вкладкой Приобретение, назовите образец, который был изображен.
Нажмите 3D Снимок для измерения голограммы клетки, используя те же углы освещения, как для 2D голограмм просто измеряется. Когда полученные данные появляются в панели управления данными, нажмите на данные и нажмите процесс, чтобы реконструировать 3D рефракционный индекс томограммы из 2D голограмм с помощью алгоритма дефракции томографии реализованы в программном обеспечении изображений. После визуализации в панели управления данными нажмите на данные и нажмите кнопку Open, чтобы визуализировать данные.
Нажмите на центр ячейки, чтобы переместить его и нажмите RI Томограмма на панели менеджера данных. На вкладке Preset нажмите Нагрузку и дважды нажмите лимфоцитов. xml, которая является предопределенной функцией передачи, предоставляемой программным обеспечением для визуализации томограммы в соответствии с дистрибутивами 3DRI.
Прокрутите мышь, чтобы увеличить и перетащить ячейку, чтобы повернуть ее в любом направлении. Для количественной морфологической и биохимической функции извлечения функции поместите все томографические данные в одну папку и разделите типы клеток на отдельные субфолдеры в основной папке. Затем откройте дополнительный файл извлечения функций в соответствующем программном обеспечении для визуализации и отредактировать строку 14 для обозначения папки томограммы, из которой должны быть извлечены данные.
Редактировать строку 15 для обозначения папки, в которую должны быть сохранены извлеченные данные функции, и выполнить код. Для каждой томограммы в наборе данных код будет вычислять площадь поверхности, объем клеток, сферичность, плотность белка и сухую массу на порог рефракционного индекса. Для контролируемого обучения и идентификации используйте простой алгоритм случайного расщепления в MATLAB, чтобы случайным образом разделить извлеченные данные функции на отдельные папки обучения и тестового набора.
Откройте дополнительный учебный файл и отредактировать строку 14 для обозначения папки набора обучения, строку 16 для обозначения папки для сохранения обученного классификатора и строку 17, чтобы установить имя файла для классификатора. Затем выполните код. Используя выбранные функции учебного набора, код будет обучать классификатор с алгоритмом ближайшего соседа K и сохранить классификатор в назначенной папке.
Затем откройте дополнительный тестовый файл три и отредактировать строки с 14 по 15, чтобы назначить обученный классификатор для тестирования и строку 17 для обозначения обученного тестового набора. Затем выполните код. Классификатор определит типы клеток отдельных лимфоцитов в тестовом наборе.
Здесь показаны репрезентативные 3D-рефракционные рефракционные томограммы В-лимфоцитов, CD4 положительные Т-лимфоциты и CD8 положительные Т-лимфоциты с различными цветовыми схемами, выделенные в соответствии с значениями рефракционного индекса, присвоенными с помощью программного обеспечения для визуализации. Из рефракционных значений индекса можно рассчитать количественные морфологические и биохимические особенности. В этом эксперименте точность классификации Т и В лимфоцитов составила 93,15% и 89,81% для учебных и тестовых случаев соответственно.
CD4 положительные и CD8 положительные Т-лимфоциты были статистически классифицированы, и точность была 87,41% и 84,38% для обучения и тестовых наборов соответственно. Наконец, точность многоклассного классификатора типа ячейки составила 80,65% и 75,93% для учебных и тестовых этапов соответственно. Качество и количество изображений имеют важное значение для успеха этой техники.
Чем лучше качество изображения и чем выше объем данных, тем выше точность идентификации. Глубокое обучение может быть использовано для более полного анализа сложных данных томограмм, что значительно повышает производительность идентификации. Кроме того, флуоресценция и 3D количественная фазовая визуализация могут быть использованы для исследования пути физиологических ролей выявленных лимфоцитов.
После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области клеточной биологии и биомедицины для изучения конкретных заболеваний, представляющих интерес в различных организмах. Действительно, иммунологи, в частности, могут извлечь выгоду из использования этой новой технологии для выявления населения, представляющих интерес.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод безмаркерной идентификации подтипов лимфоцитов с использованием количественной фазовой визуализации в сочетании с машинным обучением. Этот метод представляет собой быструю и точную альтернативу традиционному флуоресцентному маркированию и проточной цитометрии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретические основы
- Традиционные методы идентификации лимфоцитов могут быть трудоемкими и дорогостоящими.
- Флуоресцентное мечение может изменять функции клеток.
- 3D-томография показателя преломления обеспечивает детальное понимание морфологии и биохимических характеристик.
- Машинное обучение повышает точность идентификации типов клеток.
Цель исследования
- Разработать безмаркерный метод идентификации субтипов лимфоцитов.
- Повысить скорость и точность анализа лимфоцитов.
- Изучить возможности применения метода в терапии рака крови и аутоиммунных заболеваний.
Используемые методы
- Количественная фазовая визуализация для трехмерной томографии показателей преломления.
- Алгоритмы машинного обучения для идентификации типов клеток.
- Флуоресцентная сортировка клеток для сбора подмножеств лимфоцитов.
- Визуальные демонстрации для облегчения понимания метода.
Основные результаты
- Метод позволяет быстро и точно идентифицировать подтипы лимфоцитов.
- Он дает представление о популяциях лимфоцитов и других отдельных клетках.
- Данный метод применим в различных областях, помимо иммунологии.
- Наглядные демонстрации повышают качество обучения по данному протоколу.
Выводы
- Данный метод без использования меток представляет собой значительный прогресс в анализе лимфоцитов.
- Он имеет потенциальное значение для диагностики и лечения рака крови и аутоиммунных заболеваний.
- Этот подход может быть адаптирован для других типов клеток, что расширяет сферу его применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Безмаркерная идентификация субпопуляций лимфоцитов устраняет одно из основных узких мест в исследованиях в области иммунологии и иммуноонкологии, избавляя от необходимости использования флуоресцентного мечения, которое может нарушать функции клеток и вносить вариабельность. Данный метод позволяет проводить быстрый, количественный и воспроизводимый фенотипический профилинг иммунных клеток с разрешением на уровне одной клетки, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Интеграция 3D-томографии показателя преломления с машинным обучением обеспечивает масштабируемую платформу для иммунного мониторинга в доклинических моделях рака крови и аутоиммунных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать субпопуляции лимфоцитов без использования экзогенных меток, сохраняя нативный фенотип и функцию для точного тестирования гипотез о мишенях.
- Операционная ценность: снижает сложность анализа и вариабельность, связанную с окрашиванием антителами, что повышает воспроизводимость результатов между различными лабораториями и временными точками.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации иммуномодулирующих мишеней путем установления связи между морфологическими и биохимическими характеристиками и идентичностью клеток в условиях отсутствия меток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные морфологические и биохимические характеристики (например, объем, сферичность, плотность белка) из 3D-томограмм RI, что обеспечивает многопараметрическое фенотипирование иммунных клеток.
- Практическая ценность: способствует стандартизации анализа за счет внутреннего оптического контраста, устраняя эффекты разных партий антител при маркировке и вариативность оборудования.
- Масштабируемость: совместима с рабочими процессами высококонтентного имиджинга и конвейерами машинного обучения для широкомасштабного иммунного профилирования в рамках кампаний по скринингу лекарственных препаратов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет осуществлять лонгитюдное отслеживание подтипов лимфоцитов в доклинических моделях заболеваний без нарушения физиологии клеток, что способствует получению показателей эффективности, согласованных с биомаркерами.
- Механистическое снижение рисков: обеспечивает безметковую валидацию иммунного ответа клеток на терапевтические кандидаты, снижая количество ложноположительных результатов, вызванных артефактами маркировки.
- Прогностическая достоверность: обеспечивает точность более 80% при многоклассовой классификации лимфоцитов, что гарантирует надежный иммунный мониторинг в трансляционных исследованиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум поиска — от подтверждения взаимодействия с иммунной мишенью до функциональной валидации, обеспечивая безмаркерный иммунный мониторинг на этапах между идентификацией хитов и оптимизацией ведущих соединений.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез об иммуномодулирующих механизмах посредством количественного безметочного фенотипирования иммунных клеток.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные показатели (например, сухую массу, площадь поверхности), позволяющие сравнивать влияние соединений на морфологию и плотность лимфоцитов.
- Аналитика: формирует структурированные наборы признаков, совместимые с классификаторами машинного обучения, что обеспечивает объективную идентификацию типов клеток на основе данных.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническим этапом, позволяя проводить неинвазивный мониторинг динамики иммунных клеток в моделях заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для безметочного иммунного профилирования, применимую в различных терапевтических областях и модельных системах.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности, вызванной артефактами маркировки.
- Практическая ценность: повышает воспроизводимость и пропускную способность благодаря стандартизированной безмаркерной визуализации и автоматизированному извлечению признаков.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные данные об иммунном ответе, что снижает риск неудач на поздних стадиях в программах по иммуноонкологии и аутоиммунным заболеваниям.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков на основе количественных безмаркерных фенотипов иммунных клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области количественной фазовой визуализации, 3D-реконструкции томограмм и рабочих процессов машинного обучения для извлечения признаков и классификации.
- Зависит от наличия 3D-микроскопа для количественной фазовой визуализации и программного обеспечения, способного выполнять томографию показателя преломления и визуализацию томограмм.
- Необходимы стандартизированные протоколы подготовки клеток и визуализации для обеспечения качества томограмм и воспроизводимости результатов у разных пользователей и в разных центрах.
- Подразумевает адаптацию конвейеров извлечения признаков для различных подмножеств лимфоцитов или модельных систем на основе распределения показателей преломления.
- Ограничено необходимостью получения высококачественных 3D-томограмм RI; субоптимальная фокусировка или неправильная подготовка образцов могут ухудшить реконструкцию и снизить точность классификации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
3D Quantitative Phase Imaging
4:34
Quantitative Morphological and Biochemical Feature Extraction and Supervised Learning and Identification
6:42
Results: Representative Label-Free Lymphocyte Subtype 3D Phase Imaging Identification
7:56
Conclusion
