Измерение трансклеточного взаимодействия через агрегацию белка в гетерологийной клеточной системе
22 мая 2020 г.
Здесь мы представляем оптимизированный протокол для быстрого и полуквантитативного измерения взаимодействия лиганд-рецепторов в транс в гетерологозной клеточной системе с использованием микроскопии флуоресценции.
Клеточный анализ позволяет наблюдать и количественно оценивать трансадгезионные взаимодействия без необходимости длительной очистки белков или специализированного оборудования. Хотя протестированные здесь белковые взаимодействия имеют отношение к нейробиологии, этот метод может быть применен в любой области исследований, где адгезия белка происходит межклеточно. Через 48 часов после трансфекции клеток HEK-293T соберите клетки из шестилуночного планшета для агрегации.
Сначала промойте каждую лунку дважды PBS. Затем, чтобы аккуратно разъединить клетки, добавьте по одному миллилитру 10 миллимолярной ЭДТА в каждую лунку, затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия. После пяти минут инкубации аккуратно постучите по планшету, чтобы отделить клетки, и соберите каждую лунку в отдельную коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте пробирки при давлении 500 х г при комнатной температуре в течение пяти минут. Пока клетки гранулируются, подготовьте шесть инкубационных пробирок, пометив верхушки микроцентрифужных пробирок условиями эксперимента. Следует использовать все перестановки GFP и mCherry.
Удалите надосадочную жидкость из конических пробирок объемом 15 миллилитров и ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах среды. С помощью гемоцитометра подсчитайте клетки в каждой конической трубке. Затем аликвотируют по 200 000 клеток из каждого состояния в соответствующую инкубационную пробирку для получения смеси один к одному в общем объеме 500 микролитров.
После оценки исходной агрегации, описанной в следующем разделе, поместите инкубационные пробирки в медленно вращающийся пробирочный аппарат при комнатной температуре. Чтобы оценить агрегацию, на исходном уровне и повторно через 60 минут нанесите пипетку объемом 40 микролитров из инкубационной пробирки на предметное стекло заряженного микроскопа. Получение исходного уровня должно быть произведено как можно быстрее после добавления ячеек в микроцентрифужную пробирку.
Изобразите предметное стекло под флуоресценцией в зеленом и красном каналах. Для каждого слайда делайте снимки трех разных полей зрения в одной фокальной плоскости. Клетки HEK-293T трансфицировали белком, представляющим интерес, мутировавшим белком, представляющим интерес, или лигандом, представляющим интерес, и котрансфицировали флуоресцентным белком.
Клеточные популяции, экспрессирующие представляющий интерес белок, смешивали с клеточными популяциями, экспрессирующими представляющий интерес лиганд, и оценивали на предмет агрегации через 60 минут. В наложениях изображений, захваченных в зеленом и красном каналах, агрегация отображается как желтые точки. Условия, в которых клетки не экспрессировали какие-либо синаптические лиганды, показали минимальную агрегацию.
Кроме того, минимальная агрегация проявлялась, когда только одна из двух популяций экспрессировала синаптические лиганды. Агрегация не проявлялась, когда две популяции клеток экспрессировали несовместимые молекулы адгезии. Условия с совместимыми молекулами адгезии демонстрировали значительную агрегацию после 60-минутной инкубации.
Удивительно, но мутировавший белок, представляющий интерес, продемонстрировал значительно большую агрегацию, чем его аналог дикого типа, что позволяет предположить, что точечная мутация усиливает способность связывания белков. Мутации во многих молекулах адгезии обычно связаны с расстройствами развития нервной системы, нервно-психическими расстройствами и расстройствами зависимости. С помощью этого метода можно провести скрининг влияния точечных мутаций, имеющих отношение к заболеванию, на транс-взаимодействия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен оптимизированный протокол для быстрого и полуколичественного измерения взаимодействий лиганд-рецептор в транс-позиции с использованием метода флуоресцентной микроскопии на клетках HEK-293T. Данный метод позволяет количественно оценивать адгезионные взаимодействия белков, имеющие значение для нейробиологии и, потенциально, других областей исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная адгезия
- Белковые взаимодействия
Теоретические сведения
- Взаимодействия лиганд-рецептор имеют критическое значение для клеточной коммуникации.
- Понимание этих взаимодействий помогает выяснить механизмы развития нейроонтогенетических и нейропсихиатрических расстройств.
- Традиционные методы могут требовать трудоемкой очистки белков или использования специализированного оборудования.
- В данной работе предлагается более эффективный подход с использованием флуоресцентной микроскопии.
Цель исследования
- Разработать быстрый и эффективный протокол для изучения адгезии белков в клеточном анализе.
- Оценить, как точечные мутации в белках влияют на транс-взаимодействия.
- Применить этот метод в широком спектре исследований адгезии белков за пределами нейробиологии.
Используемые методы
- Для визуализации клеточных взаимодействий использовали флуоресцентную микроскопию.
- В качестве биологической модели использовали клетки HEK-293T, уделяя особое внимание трансфецированным белкам и лигандам.
- График эксперимента предусматривал оценку агрегации клеток через 60 минут после трансфекции.
- Подсчет клеток проводили с помощью гемоцитометра, после чего клетки ресуспендировали и перемешивали для последующей визуализации.
Основные результаты
- Агрегация клеток, экспрессирующих совместимые молекулы адгезии, значительно усилилась через 60 минут.
- Мутантные белки продемонстрировали более выраженную агрегацию по сравнению с белками дикого типа, что указывает на улучшение связывающих способностей.
- Минимальная агрегация наблюдалась в случаях, когда синаптические лиганды не экспрессировались или экспрессировались только одной популяцией клеток.
Выводы
- В данном исследовании представлен упрощенный метод оценки межклеточных адгезивных взаимодействий.
- Результаты подчеркивают потенциал этого метода для изучения влияния мутаций на белковые взаимодействия.
- Данные, полученные с помощью этого метода, имеют важное значение для понимания механизмов, лежащих в основе различных нейропсихических и психологических расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет напрямую измерять транс-белок-белковые взаимодействия в клеточном контексте, устраняя основной недостаток биохимических анализов, которые не позволяют отличить цис-связывание от транс-связывания. Количественно определяя только физиологически значимую межклеточную адгезию, этот метод повышает достоверность валидации мишеней и снижает количество ложноположительных результатов на ранних этапах поиска. Он способствует механистическому снижению рисков при исследовании мишеней адгезии, вовлеченных в развитие нейроонтогенетических и нейропсихиатрических расстройств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем измерения функциональной транс-адгезии между парами лигандов и рецепторов, экспрессируемых на разных клетках.
- Практическая ценность: Устраняет необходимость в очистке белков, что позволяет проводить быстрый скрининг мутантов или вариантов непосредственно в клеточной системе.
- Прогностическая ценность: Усиление агрегации при мутации, связанной с заболеванием, демонстрирует, как данный анализ может выявлять варианты с приобретением функции (gain-of-function) для их дальнейшего приоритетного изучения.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: использование флуоресцентно меченых клеток HEK позволяет получать количественные результаты визуализации (например, желтые пунктирные структуры на совмещенных изображениях) для адаптации к высокопроизводительному скринингу с анализом содержимого.
- Воспроизводимость: стандартизированные условия смешивания и инкубации клеток обеспечивают стабильность измерений агрегации в различных экспериментах.
- Масштабируемость: протокол позволяет параллельно тестировать несколько условий (например, дикий тип по сравнению с мутантным, комбинации лигандов) с помощью простых этапов смешивания и визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: позволяет напрямую проверить, как точечные мутации в молекулах адгезии, характерные для нарушений нейроразвития, нейропсихиатрических расстройств и зависимостей, влияют на транс-взаимодействия.
- Трансляционная преемственность: связывает анализы связывания in vitro с клеточными фенотипами, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) на основе функциональных данных об адгезии.
- Механистическое снижение рисков: позволяет определить, усиливают или нарушают мутации межклеточное связывание, что дает информацию о механизме действия мишени и профиле безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ занимает промежуточное положение между скринингом связывания с мишенью и функциональной валидацией, предоставляя специфические данные об адгезии для оптимизации соединений-лидеров и выбора доклинических кандидатов.
- Поисковая биология: Позволяет проверить, влияют ли генетические варианты на межклеточную адгезию, что способствует уточнению сигнальных путей и проверке гипотез о мишенях.
- Аналитика: Обеспечивает количественные результаты на основе визуализации (формирование агрегатов с течением времени) для сравнения условий и оценки силы взаимодействия.
- Трансляционные исследования: Устанавливает связь между молекулярными изменениями и клеточными фенотипами, имеющими значение для формирования синапсов и нейронной связности.
- Корпоративное повторное использование: Метод может быть адаптирован для любой системы межклеточной адгезии белков, что делает его универсальной платформой для различных терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Измеряет только транс-взаимодействия, что позволяет избежать завышения показателей связывания, характерного для анализов на основе лизатов, и повышает специфичность к мишени.
- Практическая ценность: Использует стандартные методы культуры клеток и флуоресцентную микроскопию, не требуя специализированного оборудования или сложных реагентов.
- Стратегическая ценность: Позволяет быстро оценить влияние мутаций на функцию мишени, что способствует принятию более обоснованных решений «продолжать/прекратить» при идентификации ведущих соединений.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем выявления вариантов с измененной адгезией, которые могут повлиять на эффективность или токсичность.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области трансфекции клеток млекопитающих, мечения флуоресцентными белками, а также в проведении проточной цитометрии или подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
- Метод основан на использовании флуоресцентной микроскопии с возможностью двухканальной визуализации (например, GFP и mCherry) и инструментов анализа изображений для количественной оценки агрегатов.
- Необходима стандартизация уровней экспрессии в клетках и соотношений при смешивании для обеспечения воспроизводимости результатов агрегации между различными исследовательскими группами.
- Адаптация к системам, отличным от HEK, может потребовать оптимизации эффективности трансфекции и поверхностной экспрессии молекул адгезии.
- Метод ограничен оценкой адгезии; он не позволяет регистрировать последующие события передачи сигнала или интернализации после связывания.
