Биомиметическая репликация микроструктуры поверхности корня с использованием изменения мягкой литографии
5 августа 2020 г.
Биомиметика ранее использовалась в качестве инструмента для изучения взаимодействий листовых микроорганизмов. Однако такого инструмента для корней не существует. Здесь мы разрабатываем протокол для формирования синтетических поверхностей, имитирующих микроструктуру поверхности корней для изучения корневых взаимодействий с окружающей средой.
Этот протокол позволяет разработать синтетическую систему, имитирующую микроструктуру корневой поверхности. Система может быть использована для изучения взаимодействия корневой среды в способе управления с акцентом на структуру поверхности. Это простой метод, который может быть выполнен в любой лаборатории изучения взаимодействия корневой среды.
Кроме того, этот метод позволяет образование поверхности из различных материалов. Самым сложным шагом является удаление естественного корня из отрицательной формы. Этот шаг требует нежной обработки корня, чтобы избежать разрыва корневых волос.
Визуальная демонстрация повысит способность зрителя воспроизвести эту процедуру. Начните с удаления растения из почвы после трех недель роста. Вырезать корневую систему из растения в точке взаимодействия со стеблем и положить без корней растение в стакан с водой.
Через несколько дней, сократить приключений корни, которые выходят из стебля и использовать их для репликации. Чтобы подготовить семена проросли корни, мокрая фильтровальную бумагу внутри чашки Петри с водой и положить несколько семян M82 на бумаге. Инкубировать блюдо при 25 градусах по Цельсию и увлажнять бумагу каждый день.
Приблизительно пять дней спустя, прорастающих корней будет достаточно долго, чтобы использовать для репликации. Подготовьте отрицательный раствор реплики, добавив 9,49 граммов диуретана диметарилат в 50 миллилитров чашки. Добавьте 1,45 миллилитров этилового метакрилата в чашку и храните при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет однородным и не будет выясняться.
Добавьте три миллилитров пластификатора и перемешайте раствор еще на час. Затем добавьте 300 микролитров инициатора фото и перемешайте на ночь или до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены. Чтобы создать отрицательную копию корня, возьмите чистый стеклянный слайд и налейте на него миллилитр отрицательного раствора реплики.
Поместите два-три корня над раствором, убедившись, что корни не полностью покрыты. Держите слайд под восьми ватт ультрафиолетовой лампы в течение восьми до 10 минут, а затем выключить УФ-лампу. Удалите реплику со стеклянной горки и положите ее в чашку Петри, наполненную этанолом, чтобы удалить неотредактированный мономер.
Используйте типсы, чтобы медленно и осторожно удалить корень из реплики. Чтобы подготовить раствор PDMS для положительной реплики, поместите 10 граммов диметил силоксана в чашку. Добавьте один грамм лечебного средства и тщательно перемешайте.
Нагрейте смесь в децикаторе под вакуумом в течение двух часов, чтобы удалить пузырьки воздуха. Поместите полиуретановую отрицательную реплику в чашку Петри и вылейте смесь PDMS поверх отрицательной реплики. Нанесите вакуум в течение двух часов, чтобы обеспечить покрытие микроструктуры и сохранить чашку Петри при комнатной температуре на ночь.
На следующий день отделяйте вылеченную положительную реплику от отрицательной реплики с помощью типсов. Чтобы подготовить положительную реплику из этиловой целлюлозы, добавьте 20 миллилитров этанола в чашку 100 миллилитров. Затем добавьте 1,32 миллилитров пластификатора и 3,3 грамма этиловой целлюлозы.
И перемешать раствор при комнатной температуре в течение двух часов. На следующий день налейте раствор этиловой целлюлозы поверх отрицательной реплики в чашке Петри и оставьте блюдо под капотом на ночь. Затем медленно удалите положительную реплику из отрицательной реплики с хлипами.
Хорошая негативная реплика может быть создана, если протокол следует правильно. Эта реплика покажет структуру клетки корневой поверхности, а также отверстия, представляющие расположение корневых волос. Если корень погружается в полиуретановый раствор, он будет в ловушке в твердом полимере и оставаться в отрицательной реплики после его лечения.
При лечении ультрафиолетовым светом, превышающим рекомендуемое время лечения, приведет к чрезвычайно жесткой полиуретаной плесени, что делает невозможным удалить корень, не нарушая его. Иногда корневые кусочки настолько малы, что микроскопия требуется, чтобы увидеть их. Положительные реплики были созданы с PDMS и этиловой целлюлозы.
Корневые волосы находятся в зоне удлинения, где они начинают появляться. Их длина варьируется вдоль корневой поверхности по мере того, как они становятся длиннее, подобно естественному корню. Некоторые волосы на реплике этиловой целлюлозы даже видны под световым микроскопом.
При размещении корня над отрицательным решением реплики, важно выбрать правую сторону и избежать погружения корня внутри раствора. Этот метод был разработан, чтобы предоставить новый путь для исследования взаимодействия корневой поверхности окружающей среды. В частности, физические силы, вызванные микроструктурой и материальными свойствами поверхности.
Обзор
Данный протокол позволяет создавать синтетические поверхности, имитирующие микроструктуру поверхности корня, что способствует проведению контролируемых исследований взаимодействий корня с окружающей средой. Этот метод прост в исполнении и может быть реализован в любой лаборатории, специализирующейся на изучении корней.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомиметика
- Биология растений
- Микроструктура корня
Теоретическая часть
- В предыдущих исследованиях биомиметика применялась для изучения взаимодействий между листьями и микроорганизмами.
- До настоящего времени не существовало инструментов для изучения взаимодействий в корневой зоне.
- Данная работа восполняет этот пробел путем создания синтетических поверхностей корней.
- В протоколе подчеркивается важность структуры поверхности при изучении взаимодействия корней с окружающей средой.
Цель исследования
- Разработать синтетическую систему, имитирующую микроструктуру поверхности корня.
- Обеспечить возможность проведения контролируемых исследований взаимодействий между корнем и окружающей средой.
- Предложить воспроизводимую методику для исследователей в области биологии растений.
Используемые методы
- Экстракция корней растений и изготовление негативных форм.
- Использование диуретандиметакрилата и этилметакрилата для создания негативных реплик.
- Изготовление позитивных реплик с использованием PDMS и этилцеллюлозы.
- Визуальные демонстрации для облегчения воспроизведения процедуры.
Основные результаты
- Успешное получение негативных и позитивных реплик поверхностей корня.
- Реплики точно отображают структуру клеток и расположение корневых волосков.
- Продемонстрирована возможность использования различных материалов для репликации поверхности.
- Получены данные о физических силах, влияющих на взаимодействие корня с окружающей средой.
Выводы
- Данный метод открывает новые возможности для исследования взаимодействий на поверхности корня.
- Он позволяет детально изучать влияние микроструктуры на поведение корня.
- В будущих исследованиях данный протокол может быть использован для изучения различных факторов окружающей среды.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности и бизнеса
Эта биомиметическая платформа позволяет контролируемо исследовать влияние микроструктуры поверхности корня на микробные взаимодействия, восполняя критический пробел в исследованиях взаимодействия растений и микробов. Путем воспроизведения тонких структур корневых волосков в синтетических материалах данный метод позволяет механистически проверить гипотезы, касающиеся опосредованных поверхностью биологических процессов. Этот подход представляет собой масштабируемую и многоразовую систему для оценки того, как физические особенности поверхности влияют на колонизацию микробами и секрецию ферментов в рамках рабочих процессов по поиску новых биомолекул.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать взаимосвязь между структурой и функцией в режиме взаимодействия корней с микробами путем выделения топографии поверхности в качестве независимой переменной.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимые синтетические поверхности для последовательной проверки гипотез в различных экспериментальных повторностях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать количественно определяемые микроструктурные шаблоны для стандартизированной оценки адгезии микроорганизмов и ферментативной активности.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность использования различных материалов (ПДМС, этилцеллюлоза) для адаптации свойств поверхности под конкретные цели скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает отслеживание локализации микроорганизмов относительно определенных особенностей поверхности, что позволяет сопоставить микроструктуру с функциональными результатами, такими как секреция целлюлазы.
- Практическая ценность: предоставляет вариант использования подверженного деградации этилцеллюлозного покрытия для моделирования динамических изменений поверхности в доклинических исследованиях при воздействии микроорганизмов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод применяется на этапе поисковой биологии, позволяя формулировать гипотезы о поведении микроорганизмов при взаимодействии с поверхностями до начала скрининга соединений или этапа оптимизации ведущих структур.
- Фундаментальная биология: способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет возможности систематического изменения плотности корневых волосков и характеристик зоны удлинения для проверки их влияния на поведение микроорганизмов.
- Скрининг: позволяет создавать стандартизированные, воспроизводимые поверхности для высокоточного анализа микробных взаимодействий в контролируемых условиях поверхности.
- Аналитика: обеспечивает пространственное картирование расположения микроорганизмов относительно микроструктуры поверхности, предоставляя количественные данные на основе визуализации для исследований взаимодействий.
- Трансляционные исследования: связывает анализ микроструктуры на этапе фундаментальных открытий с доклинической валидацией посредством биомиметических поверхностей, отражающих естественную архитектуру корней.
- Корпоративное повторное использование: создает платформенную технологию, применимую к различным видам растений и микробным системам, что сокращает необходимость в избыточной разработке моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность в исследованиях взаимодействия корней с микробами путем отделения структуры поверхности от химических и биологических переменных.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов формования и репликации, совместимых со стандартным лабораторным оборудованием.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go), предоставляя прогностические модели поверхности, которые снижают зависимость от вариабельных природных образцов.
- Влияние на портфель исследований: Позволяет проводить приоритизацию микробных мишеней или соединений с учетом рисков на основе профилей взаимодействия, зависящих от структуры.
Рекомендации по внедрению
- Для успешного создания формы требуются навыки работы с растительными тканями и методами мягкой литографии.
- Для получения реплик без пузырьков воздуха необходимо оборудование для УФ-отверждения и вакуумный эксикатор.
- Требуются стандартизированные протоколы подготовки корней для обеспечения единообразного переноса микроструктуры между сериями образцов.
- В зависимости от целей исследования требуется компромиссный выбор материалов между долговечностью PDMS и биоразлагаемостью этилцеллюлозы.
- Ограничением является необходимость осторожного извлечения корня для сохранения хрупких структур корневых волосков при создании негативной формы.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
