Стратегия биосенсорного анализа высокой пропускной способности и биоинформатики для глобальной проверки взаимодействий между наркотиками и белком

Идентификация низкомолекулярных белковых взаимодействий имеет важное значение для исследований и разработки лекарств, а также для углубления понимания патологических механизмов, лежащих в основе DTC вируса. Этот метод способствует высокопроизводительной биопанорамной обработке пептидов, распознающих лекарственные средства, и глобальной валидации сайтов связывания лекарственных средств на белках для низкомолекулярных лекарственных средств, представляющих интерес. Чтобы получить чип датчика ККМ, прикрепите керамический чип датчика к генератору аппарата СМК с частотой 27 МГц и зарегистрируйте собственную частоту в воздушной фазе перед иммобилизацией малых молекул.

После записи отсоедините микросхему и осторожно добавьте 20 микролитров капли одномиллимолярного мелкомолекулярного производного в 70% этанола для создания самоорганизующегося монослоя на золотом электроде сенсорной микросхемы. Поместите чип в чашку Петри, выстланную влажной тканью, защитите ее от света в течение одного часа при комнатной температуре, а затем аккуратно промойте поверхность электрода ультрачистой водой. Высушите чип под легким воздействием воздуха и загрузите чип на аппарат QCM.

Через час запишите уменьшение частоты в воздушной фазе, чтобы измерить количество малой молекулы, которая была иммобилизована. Для биопанорамирования T7 Phage Library поместите кювету со специальной магнитной мешалкой на биосенсор QCM, настроенный на 1000 оборотов в минуту, и добавьте восемь миллилитров реакционного буфера в кювету Во время перемешивания буфера присоедините чип датчика QCM к генератору Удерживайте рычаг генератора, чтобы погрузить чип в буфер и начать мониторинг частоты QCM. Когда грамм сенсора уравновешивается с частотным дрейфом примерно в три Гц в минуту, введите восемь микролитров библиотеки фагов Т7 в кювету и отметьте точку инжекции на датчике.

Отслеживайте снижение частоты, вызванное связыванием фагов Т7 с небольшой молекулой, иммобилизованной на поверхности золотого электрода. Через 10 минут остановите частотный монитор QCM и быстро поднимите генератор, чтобы извлечь микросхему датчика из пакета, отсоедините микросхему датчика от генератора и снимите буфер с микросхемы. Поместите высушенный сенсорный чип во влажную чашку Петри и добавьте 20 микролитров капли логарифмической фазы E-coli на золотой электрод.

Инкубируйте чашку на 96-луночном микропланшетном миксере при температуре 37 градусов Цельсия и частоте от 1000 до 1500 оборотов в минуту в течение 30 минут, защищенной от света, чтобы усилить восстановление связанных семи фагов Т7. В конце инкубации переложите 20 микролитров суспензии кишечной палочки в 200 микролитров ЛБ среды. В соответствии с общей методикой проводят выделение фаговой бляшки в среде и секвенирование ДНК, кодирующей распознавание пептидных последовательностей препарата, отображаемых на каждом фаговом капсиде.

В качестве послеоперационного обслуживания чипа датчика используйте 1% раствор додецилсульфата натрия, смоченный ватным тампоном, для очистки поверхности электрода промойте золотую поверхность ультрачистой водой и высушите электрод воздухом. Затем обработайте поверхность электрода пятью микролитрами свежеприготовленного раствора Параны в течение пяти минут, после чего следует промывка ультрачистой водой и сушка на воздухе два раза. Для проведения биоинформатического анализа с помощью RELIC распакуйте автономную программу RELIC на ПК с операционной системой Windows и используйте аминокислотные последовательности выбранных лекарств 15 мер-пептидов или одного или нескольких белков в каждом текстовом файле с быстрым форматом A.

Поместите необходимые текстовые файлы в папку AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con или fast A scan. Щелкните каждый исполняемый файл в независимой папке, чтобы открыть персональную версию FTN 95, и введите соответствующее имя файла и расширение в командной строке, чтобы выполнить каждую программу и получить полученный файл в текстовом формате. Полученные файлы в текстовом формате показаны здесь.

Затем экспортируйте полученный текстовый файл в электронную таблицу для создания графика информационного наполнения или кумулятивных оценок сходства, рассчитанных с помощью удара около 62. Используя эту стратегию, были успешно идентифицированы одиночные и множественные сайты связывания малых молекул на белках-мишенях для шести низкомолекулярных препаратов. Например, 29 пептидов, которые распознают клинически одобренный препарат иринотекан, иммобилизованный как самоорганизующийся монослой, были идентифицированы с помощью биосенсора QCM на основе биопанорамирования за один цикл. Последующее попарное выравнивание 29 пептидов и ацетилхолинэстеразы дало максимальные баллы для специфических аминокислотных остатков, которые соответствовали тем, которые составляют сайт связывания иринотекана.

Это же подмножество пептидов было успешно идентифицировано в непосредственной близости от каталитической триады в карбоксилэстеразе, что указывает на то, что эти аминокислоты образуют каркас для распознавания иринотекана во время деэтерификации. 27 пептидов, которые распознают противогриппозный препарат осельтамивир, покрывая поверхность золотого электрода чипа датчика QCM, успешно обнаружили сайт связывания осельтамивира в нейраминидазе. Этот сайт связывания состоит из неструктурированных пептидных пептидных петель, которые потенциально подвергаются динамическому движению при стыковке с осельтамивиром.

Лекарственные препараты, регионы, химические вещества, рекомбинантные бактериофаги и бактерии являются биологическими катафалками и должны обрабатываться в соответствии с протоколом получения культуры. Не забывайте всегда надевать перчатки, очки и лабораторный халат для безопасности. После этой процедуры белки-мишени для различных лекарств могут быть глобально валидированы на людях, патологических вирусах и даже растениях, чтобы понять молекулярные механизмы и потенциальную терапевтическую эффективность интересующих лекарств.