Применение системы RatWalker для анализа походки в генетической крысиной модели болезни Паркинсона
18 января 2021 г.
Здесь мы описываем систему RatWalker, построенную путем перепроектирования аппарата MouseWalker для размещения увеличенных размеров и веса крыс. Эта система использует разочарованное полное внутреннее отражение (FTIR), высокоскоростной захват видео и программное обеспечение для анализа с открытым доступом для отслеживания и количественной оценки параметров походки.
Этот метод позволяет воспроизводимо количественно оценить различия в параметрах походки. Параметры походки могут быть оценены у свободно ходячих грызунов, и техника не полагается на инвазивные шаги, такие как погружение ног чернилами. Продемонстрировать процедуру будет Бен Ламберти.
Начните с размещения домашней клетки в конце дорожки перед началом каждого пробега, чтобы служить положительным сигналом для крысы, чтобы пересечь дорожку. Выключите свет в комнате. Включите камеру и начните запись за несколько секунд до того, как крыса будет помещена на платформу.
Установив вольер, поместите крысу в конце дорожки, напротив домашней клетки, и позвольте ей ходить по дорожке невынужденным образом. Прекратите запись, как только животное достигнет конечной точки дорожки. Очистите дорожку, используя 70% этанол и неабразивное полотенце между пробежками и после того, как животное мочится или испражняется.
Затем дайте этанолу испариться перед введением другого животного. Пропустите крыс через дорожку в общей сложности семь раз в течение каждого периода наблюдения, принимая первые три пробега, которые оцениваются, как проходные для анализа. Оцените бег как проходной, если животное делает четыре или более последовательных шага в направлении домашней клетки без перерыва из-за груминга, паузы или ошибочных движений.
Анализ походки был проведен на самцах крыс дикого типа и Parkin DKO в двухмесячном возрасте, чтобы определить, может ли использование кинематического анализа походки выявить тонкие двигательные нарушения до появления грубых двигательных проблем. Несмотря на увеличенный вес крыс DKO, давление ног, приложенное к поверхности ходьбы, не изменилось. После оценки нескольких параметров походки в зависимости от скорости ходьбы было обнаружено, что скорость ходьбы и длина шага схожи между крысами дикого типа и DKO.
Различия между крысами дикого типа и DKO стали очевидными в фазе стойки и продолжительности качелей на более медленных скоростях ходьбы. Часть цикла шага, где нога находится в фазе стоя, была фактором нагрузки. Больше времени было потрачено на фазу свинга, чем на фазу стойки, поскольку коэффициент дежурства уменьшился.
Кроме того, в то время как скорость качелей увеличивалась с увеличением скорости у диких животных, корреляция была притуплена у крыс DKO. Анализ походки FTIR также использовался для создания графиков следов фазы стойки каждой ноги относительно тела у свободно ходячих крыс. При сравнении положения лапы наблюдались значительные изменения AEP и PEP.
Несколько дополнительных параметров были значительно изменены у крыс DKO по сравнению с диким типом. Скорость поворота как левой, так и правой задних конечностей была увеличена у крыс DKO, в то время как продолжительность колебаний как левых, так и правых задних конечностей была уменьшена. Последовательная настройка оборудования, включая положение камеры по отношению к RatWalker, важна для успешной реализации этого протокола.
После выполнения этого протокола животные доступны для любого дополнительного поведения или необходимых экспериментальных конечных точек. Например, изменения походки могут быть коррелированы с гистологическими изменениями. Этот метод может быть использован для оценки походки в других моделях грызунов без БП, таких как модели тревоги и депрессии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена система RatWalker, разработанная для анализа походки свободно передвигающихся крыс с использованием метода полного внутреннего отражения с фрустрированием (FTIR) и высокоскоростной видеосъемки. Она позволяет точно количественно оценить параметры походки, что дает возможность изучить двигательные нарушения, в частности у генетически модифицированных крыс Parkin DKO.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческий анализ
- Оценка походки
Теоретические основы
- Анализ походки у грызунов обычно основывается на инвазивных методах.
- Предыдущие исследования показали необходимость в усовершенствованных неинвазивных методах оценки моторной функции.
- RatWalker представляет собой модификацию системы MouseWalker, адаптированную для более крупных грызунов.
- Данная система позволяет выявить незначительный моторный дефицит до появления явных симптомов.
Цель исследования
- Разработать неинвазивный метод анализа походки у крыс.
- Исследовать различия в походке крыс дикого типа и крыс Parkin DKO.
- Установить надежный протокол для отслеживания параметров походки в нескольких сериях опытов.
Используемые методы
- Для анализа походки свободно передвигающихся крыс использовалась система RatWalker.
- В качестве биологических моделей применялись самцы крыс дикого типа и крысы с двойным нокаутом по гену Parkin (DKO) в возрасте двух месяцев.
- В исследовании не упоминались рабочие процессы мультиомики.
- Крысы проходили по дорожке в общей сложности семь раз; оценка проводилась на основе последовательных шагов.
- Параметры походки количественно определяли с помощью ИК-фурье-спектроскопии (FTIR) и видеоанализа.
Основные результаты
- Анализ походки выявил значительные различия в фазе опоры и продолжительности фазы переноса у крыс DKO при низких скоростях движения.
- Несмотря на схожую скорость ходьбы, у крыс DKO наблюдались измененные временные параметры походки по сравнению с крысами дикого типа.
- У крыс DKO отмечены важные изменения в позиционировании лап и скорости фазы переноса.
- Исследование подчеркивает важность единообразия оборудования для получения достоверных результатов.
Заключение
- Система RatWalker позволяет проводить неинвазивный анализ походки с потенциалом для более широкого применения на различных моделях грызунов.
- Полученные результаты способствуют пониманию механизмов двигательной дисфункции в генетических моделях заболеваний.
- Результаты исследования могут быть использованы при изучении нарушений походки, связанных с различными неврологическими состояниями.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Раннее выявление незначительных двигательных нарушений в генетических моделях способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в программах по изучению нейродегенеративных заболеваний. Система RatWalker позволяет проводить неинвазивный количественный анализ походки, который может определить фенотипические изменения до появления грубых двигательных дефицитов, что повышает прогностическую достоверность при доклиническом скрининге. Данный подход помогает приоритизировать терапевтических кандидатов, предоставляя транслируемые биомаркеры функционального снижения в моделях болезни Паркинсона.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения параметров походки на генетических моделях болезни Паркинсона у крыс.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет воспроизводимой оценки двигательной функции у свободно передвигающихся грызунов.
- Прогностическая ценность: облегчает раннюю фенотипическую характеристику для повышения уверенности в выбранной мишени и принятия решений по приоритизации портфеля препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные походки с высоким разрешением, включая фазу опоры, длительность фазы переноса и положение лап для проведения сравнительного анализа.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированные, масштабируемые результаты, подходящие для разработки методов анализа и кампаний по скринингу соединений.
- Воспроизводимость: Требует единообразной настройки оборудования и критериев оценки для обеспечения надежности данных в различных сериях экспериментов и лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Сопоставление изменений походки с гистологическими конечными точками для установления связи между поведенческими и нейропатологическими результатами.
- Релевантная модели болезни: Моделирование ранних стадий моторной дисфункции при генетической болезни Паркинсона до появления явных симптомов.
- Механистическое снижение рисков: Идентификация биомаркеров походки, отражающих лежащую в основе нейропатологию в моделях с дефицитом Parkin/Pink1.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Система RatWalker встраивается в континуум исследований — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, обеспечивая итеративную оценку моторных фенотипов на различных этапах исследования.
- Открытийная биология: Поддержка проверки гипотез путем измерения нарушений походки в генетических моделях для подтверждения воздействия на мишень и модуляции сигнальных путей.
- Скрининг: Предоставление количественных данных, готовых к анализу, для оценки терапевтического эффекта на двигательную функцию в моделях грызунов.
- Аналитика: Получение кинематических параметров, таких как коэффициент нагрузки (duty factor), скорость переноса конечности и симметрия шага, для объективного сравнения различных генотипов.
- Трансляционные исследования: Возможность корреляции изменений походки с маркерами нейродегенерации для подтверждения соответствия биомаркеров и углубления понимания патофизиологии.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой масштабируемую неинвазивную платформу, применимую для множества моделей неврологических заболеваний, помимо болезни Паркинсона.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет выявления ранних двигательных нарушений, которые отражают клинические продромальные симптомы.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированному прохождению по дорожке, пороговым значениям оценки и контролю условий окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), снижая зависимость от фенотипических показателей на поздних стадиях доклинических исследований.
- Влияние на портфель: Обеспечивает продвижение проектов с учетом рисков путем идентификации моделей с конструктивной валидностью для скрининга терапевтических средств.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области поведенческой нейробиологии и видеоанализа движений для правильной настройки и интерпретации результатов.
- Результаты зависят от стабильного положения камеры, условий освещения и чистоты дорожки для минимизации вариативности.
- Необходима согласованность между членами исследовательской группы относительно критериев подсчета проходов (например, четыре последовательных шага) для обеспечения сопоставимости данных.
- При адаптации системы для других моделей или линий грызунов необходимо учитывать видоспецифические особенности локомоции.
- Метод ограничен оценкой временных и пространственных параметров походки; он не позволяет фиксировать сложные локомоторные последовательности или тонкую кинематику конечностей без использования дополнительных методов.
