Усовершенствованная очистка тканей на основе CLARITY для трехмерной организации фибробластов в здоровых и поврежденных сердцах мышей
16 мая 2021 г.
Усовершенствованный метод очистки тканей был разработан и применен к сердцу взрослой мыши. Этот метод был разработан для очистки плотной, аутофлуоресцентной сердечной ткани, сохраняя при этом меченую флуоресценцию фибробластов, приписываемую стратегии генетического репортера.
Этот новый протокол очистки тканей улучшает существующую технологию, чтобы обеспечить более точный взгляд in vivo на конкретные типы клеток в сердце и их поведение в условиях травмы. Этот протокол быстрый и довольно простой. Это позволяет сохранять флуоресценцию marca с минимальным вмешательством от фоновой автофлуоресценции тканей, не требуя окрашивания клеток или тканей.
Начните с использования 70% марлевой прокладки, пропитанной этанолом, чтобы очистить вентральную поверхность экспериментальной мыши. Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать трехсантиметровый поперечный разрез, примерно на три метра ниже клифового отростка и деглавировать мышь от брюшной полости к клифовому отростку, чтобы отделить кожу от подлежащей ткани брюшной стенки. Сделайте двухсантиметровый поперечный разрез в подкожной ткани брюшной стенки, на три сантиметра ниже кистевидного отростка и сделайте вертикальный разрез от этого разреза вверх по средней линии через грудную клетку.
Закрепите грудную клетку назад, чтобы обнажить сердце. И используйте 10-миллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, чтобы ввести холодный PBS в верхнюю полую вену и аорту. Когда вся кровь будет смыта из сердца, доставить 10 миллилитров холодного 4% PFA в верхнюю полую вену и аорту, чтобы начать процесс фиксации.
Когда все фиксаторы будут мигать, иссекните сердце и используйте скальпель с прямым лезвием, чтобы отделить предсердия, правый желудочек и перегородку и левый желудочек. Поместите сердце в 15-миллилитровую коническую трубку с холодным 4% PFA для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия на нутаторе. На следующее утро добавьте 0,25% раствор инициатора фото в свежеприготовленный раствор гидрогелей и перенесите сердце на гидрогель.
Заверните коническую трубку в фольгу для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия без физического нарушения. На следующее утро согрейте трубку в бисероплетении 37 градусов по Цельсию в течение 2,5 часов, прежде чем использовать щипцы, чтобы аккуратно перевести сердце в 15-миллилитровую трубку PBS. Трижды вымойте сердце в PBS в течение одного часа за стирку при 37 градусах Цельсия на нутаторе и переложите сердце в корзину активного электрофореза.
Закрепите крышку на месте и заполните резервуар активной камеры электрофореза раствором для очистки электрофореза. Как только камера заполнётся, погрузьте корзину в раствор и затяните колпачок на электрофорезной машине на место. Затем запустите аппарат электрофореза при 1,5 амперах и 37 градусах Цельсия в течение 1,5 часов.
После электрофореза проверьте сердце визуально, чтобы убедиться, что не осталось непрозрачной ткани. Промыть очищенное сердце три раза по 15-миллилитр два в течение одного часа в свежем PBS при 37 градусах Цельсия за стирку на нутаторе. Перед погружением сердца в обесцвечивающее средство для уменьшения гемовой автофлуоресценции.
Через 48 часов промыть сердце три раза в PBS, как показано на демонстрации, и уравновесить сердце в свежеприготовленных RIMS в течение 48 часов до визуализации. Для 3D-визуализации очищенного сердца, во-первых, поместите тонкий слой вакуумной смазки на дно 3D-печатного нижнего резервуара, той же высоты, что и визуализируемый образец. Заполните резервуар RIMS и используйте наконечник пипетки, чтобы удалить пузырьки.
Осторожно поместите сердце в RIMS стенкой левого желудочка лицом вверх, заботясь о том, чтобы в раствор не вводились пузырьки. Используйте вакуумную смазку, чтобы прикрепить стеклянную крышку к нижней поверхности 3D-печатного верхнего куска резервуара и поместить верхнюю крышку резервуара вниз на нижние резервуары, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков. Затем заполните верхние резервуары глицерином.
Используйте конфокальный микроскоп для изображения очищенных сердец. Сочетание усовершенствованной очистки сердечной ткани с 3D-визуализацией позволяет продвинутую детальную визуализацию сердечных фибробластов. Используя этот метод визуализации, фибробласты, как наблюдается, плотно упакованы и имеют веретенообразный морфологию в неповрежденные сердца.
После реперфузионного повреждения ишемией в течение первых трех дней после травмы наблюдается потеря сердечных фибробластов в ишемической области. К седьмому и 14-му дню фибробласты мигрировали или размножились, чтобы повторно заселить поврежденную область ткани. К 28-му дню популяция сердечных фибробластов, окружающая поврежденные участки сердца, достигла наибольшей плотности.
Через полтора дня после повреждения инфаркта миокарда в поврежденном левом желудочке остается мало фибробластов. Однако к третьему дню фибробласты расширяются и присутствуют в большей части левого желудочка. В отличие от ишемической хирургии, инфузия ангиотензина два и фенолефрина в течение нескольких недель не приводит к потере сердечной ткани и истончению стенки.
Вместо этого фибробласты выравниваются вдоль оси схемы сокращения спирали правой руки, как видно при использовании протокола очистки очищения тканей. Кроме того, после лечения ангиотензином два и фенолефрином фибробласты кажутся маленькими и округлыми, в отличие от формы веретена, наблюдаемой в моделях репрофузии ишемии и повреждения инфаркта миокарда. Электрофоретическая очистка должна выполняться осторожно, особенно при работе с сердцами, которые подверглись протоколам травмы.
Этот протокол может быть использован для оценки того, как сердечные фибробласты реагируют на травму in vivo. Различные флуоресцентные маркеры также могут быть использованы, чтобы понять, как сердце реагирует на травму на клеточном уровне.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Был разработан усовершенствованный метод просветления тканей сердца взрослой мыши, позволяющий визуализировать определенные типы клеток при минимизации фоновой автофлуоресценции. Данный протокол расширяет возможности существующих методов исследования сердечной ткани.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Сердечно-сосудистая биология
- Тканевая инженерия
Теоретические сведения
- Методы просветления тканей необходимы для визуализации плотных биологических тканей.
- Автофлуоресценция может маскировать специфические клеточные сигналы при проведении визуализационных исследований.
- Сохранение флуоресценции меченых клеток имеет решающее значение для точности анализа.
- Существующие методы могут требовать окрашивания, что усложняет процесс.
Цель исследования
- Разработать быстрый и простой протокол просветления тканей.
- Улучшить визуализацию флуоресценции фибробластов в ткани сердца.
- Снизить фоновые помехи, вызванные автофлуоресценцией.
Используемые методы
- Использовали 70% этанол для очистки вентральной поверхности мыши.
- Выполнили хирургические разрезы для получения доступа к сердцу.
- Применили новый протокол просветления к ткани сердца.
- Сохранили флуоресценцию маркера без окрашивания.
Основные результаты
- Новый протокол эффективно обеспечил просветление плотной сердечной ткани.
- В ходе процесса была сохранена флуоресценция фибробластов.
- Фоновая автофлуоресценция была значительно снижена.
- Данный метод позволяет улучшить визуализацию клеток сердца in vivo.
Выводы
- Этот усовершенствованный метод расширяет возможности исследования сердечной ткани.
- Он представляет собой ценный инструмент для исследователей, изучающих реакции на повреждение сердца.
- Данный протокол эффективен и сводит к минимуму необходимость в дополнительном окрашивании.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание динамики кардиальных фибробластов в трехмерном пространстве дает важнейшее представление о механизмах фиброза, которые определяют жесткость желудочков и прогрессирование сердечной недостаточности. Этот усовершенствованный метод просветления тканей на основе CLARITY обеспечивает высокоточную визуализацию поведения фибробластов во всем органе без ограничений по проникновению антител или потери флуоресценции, что способствует снижению механистических рисков при валидации сердечно-сосудистых мишеней. Данный метод обладает прогностической ценностью, выявляя пространственно разрешенные ответы фибробластов на модели ишемического и неишемического повреждения, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки на ранних этапах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать локализацию и морфологию фибробластов в интактной ткани для разграничения патогенной и репаративной ролей при фиброзе миокарда.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем установления связи между генетической маркировкой фибробластов (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) и пространственными фенотипами в здоровых и поврежденных сердцах.
- Прогностическая значимость: выявляет специфичные для типа повреждения паттерны фибробластов — такие как выравнивание в виде полос после введения ангиотензина II/фенилэфрина или репопуляция из пограничных зон после ишемии — что позволяет снизить риски при выдвижении механистических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет получить просветленные, флуоресцентно меченые сердца, пригодные для конфокальной микроскопии с целью количественного 3D-анализа плотности, распределения и морфологии фибробластов.
- Воспроизводимость: стандартизированное просветление на основе электрофореза (1,5 amps, 37°C, 1,5 hours) и уравновешивание в RIMS обеспечивают однообразные оптические свойства тканей во всех экспериментальных группах.
- Масштабируемость: совместимость с многообразцовой обработкой в камерах активного электрофореза позволяет проводить параллельное сравнение моделей контроля, ишемического и гипертензивного повреждения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, релевантная заболеванию: фиксирует ответы фибробластов в моделях, имитирующих ишемическое повреждение (реперфузию) и перегрузку давлением (ангиотензин II/фенилэфрин) у человека, что соответствует клиническим фенотипам фиброза.
- Трансляционная преемственность: отслеживает гибель фибробластов, репопуляцию пограничной зоны и пики плотности на 28-й день после ишемии — ключевые временные окна для тестирования антифиброзной терапии.
- Механистическое снижение рисков: позволяет отличить профибротические веретенообразные фибробласты при ишемии от мелких округлых фенотипов при гипертензии, что дает возможность проводить модуляцию специфических таргетных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от проверки гипотез о мишенях до идентификации соединений-лидеров, предоставляя пространственно-разрешенные фенотипические данные, которые связывают результаты исследований in vitro с функциональными исходами в доклинических моделях.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы об активации, миграции и пролиферации фибробластов в контексте 3D-ткани, проясняя вклад сигнальных путей в развитие фиброза.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных данных визуализации (плотность, ориентация и морфология фибробластов), подходящих для высококонтентного анализа в каскадах скрининга соединений.
- Аналитика: поддерживает морфометрический и пространственный статистический анализ сетей фибробластов, что позволяет проводить сравнение по различным генотипам, видам повреждений и временным точкам.
- Трансляционные исследования: связывает динамику фибробластов с временными рамками желудочкового ремоделирования, обеспечивая доклиническую валидацию с использованием биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для просветления тканей и визуализации, применимую к различным моделям сердечно-сосудистых заболеваний и типам клеток, помимо фибробластов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает неопределенность механизмов функционирования фибробластов за счет сохранения нативной архитектуры ткани и целостности флуоресцентного сигнала.
- Операционная ценность: Устраняет необходимость в нарезке и окрашивании, что снижает вариабельность рабочего процесса и увеличивает пропускную способность при 3D-фенотипировании.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), выявляя целевые ответы фибробластов, которые предсказывают функциональные исходы в моделях сердечной недостаточности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию антифибротических мишеней с учетом рисков на основе пространственно подтвержденного взаимодействия с мишенью и фенотипической модуляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области хирургии сердца мышей, перфузионной фиксации и методов просветления тканей на основе гидрогелей.
- Зависит от наличия оборудования для активного электрофореза, конфокального микроскопа и монтажных растворов RIMS/глицерин.
- Необходимо стандартизировать время и температуру просветления, чтобы предотвратить чрезмерное обесцвечивание или возникновение автофлуоресценции в поврежденных тканях.
- Адаптация к другим моделям заболеваний может потребовать оптимизации времени обесцвечивания для снижения фона, вызванного гемом, без гашения сигнала GFP.
- Практическое ограничение: стабильность при длительном сканировании зависит от надлежащего уравновешивания в RIMS для предотвращения несоответствия показателей преломления и деградации сигнала.
