Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции
25 апреля 2021 г.
Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.
Лучший принцип спектроскопии корреляции флуоресценции, FCS, был изобретен первоначально в 1970-х годах. В 1990-х годах, важные и многие улучшения для FCS была создана путем объединения с конфокальные микроскопии аппарата. С тех пор FCS используется для многих химических и вирусных приложений лечения, таких как молекулярные взаимодействия и анализ агрегации белка.
Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств. Яркость флуоресценции – это одиночные частицы в действии молекулярных размеров, которые объясняются диффузионные свойствами. Это очень важно в измерении агрегации белка, потому что он может определить прогнозируемые жизненные циклы молекул, но и различать гомо или гетеро полимеризации.
Здесь мы вводим процедуру измерения диффузии бокового амиотрофического склероза, связанного с агрегированным протеином формы с использованием FCS в клеточных лизорах и живых клетках. Приготовьте 100-миллиметровую пластиковую тарелку, растущую в клетке Neuro2a, удобно сидящую в нормальной среде роста. Подтвердите слияние клеток.
Удалите носитель. Добавьте 3,5 миллилитров раствора Трипсин-ЭДТА в третье блюдо картриджа и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение одной минуты. Добавить 9,5 миллилитров нормального роста среды в блюдо и приостановить их.
Подвеска клетки смешана с трипан-синим цветом, чтобы испачкать мертвые клетки. Добавьте подвеску к слайду подсчета ячееок. Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек или вручную.
Проверьте живой номер ячейки и их жизнеспособность. Разбавить ячейку в подсчитанной среде в 1,0 раза 10 до мощности 5 на миллилитр. Добавьте два миллилитров клеточной суспензии в 35-миллиметровую пластиковую тарелку для клеточного лиза или пространство роста для измерения живых клеток.
Инкубировать блюдо при 37 градусах по Цельсию в течение одного дня. На следующий день приготовьте смесь плазмидной ДНК и трансфектных реагентов. Добавьте смесь трансфекции в клеточную среду и инкубировать клетки в течение 24 часов.
Один день спустя. Проверьте выражение GFP с помощью обычного микроскопа. Вы можете увидеть очень яркие тела ингредиента TDP25 в клетках.
Клеточныйлиз следует проводить на биохимической скамейке. Удалите среду в блюдо. Добавить два миллилитров PBS при 25 градусах по Цельсию, чтобы мыть как средство.
Удалите PBS. Поместите блюдо на алюминиевую тарелку поверх дробленого льда. Немедленно добавьте буфер лиза микролитера 200 в тарелку.
Очисти блюдо с помощью клеточного скребка. Восстановите лизат с неоконсеримым клеточным мусором в новой 1,5-миллиметровой трубке. Центрифуга лисировать при четырех градусах по Цельсию.
Для измерения живых клеток замените носитель на свежий перед измерением. Проверьте вложение клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. Кроме того, проверьте выражение GFP с помощью флуоресцентной микроскопа.
Используйте конфокальцированную систему FCS, комбинированную с микроскопом. Включите 488 нанометровый лазер. Стабилизировать систему, по крайней мере, в течение 30 минут.
Настройка оптического пути. Используйте 488 нанометровый лазер для мгновенного света. Используйте соответствующий пучок сплиттера и дихроических метров.
А также, флиоресценции предохранители. Как правило, мы будем использовать крышки камер для калибровки и измерения раствора. Осторожно, возьмите крышку камеры.
Поместите стеклянную поверхность на скрининговую бумагу объектива. Налейте калибровку FCS. Добавить раствор родамин 6G, а также.
Добавьте ультрачистую воду на цель. Не используйте масло. Установите камеру на сцене микроскопа.
Перемести сцену в соответствующее положение. Создайте регулировку пинхол и откройте мастер регулировки пинхол. Мониторинг скорости подсчета фотона как грубого движения пинхол для x-направления.
Самая яркая позиция была правильно определена. Далее, контролировать скорость подсчета фотона, как тонкое движение. Самая яркая позиция была успешно определена Это положение пинхол для X-направления.
Точно так же ищите самое яркое положение пинхол для направления y. Также была успешно определена самая яркая позиция по у-направлению. Соединение x и y положение пинхол.
Лучше настроить положение пинхол перед каждым днем измерения. Когда живой путь изменен, положение пинхол должно быть отрегулировано снова. Создайте скорость подсчета и отслеживайте скорость подсчета телефона.
Изменение режима мониторинга CPM. Подсчитайте кольцо коррекции объекта, который вы запустили, чтобы значение CPM было самым высоким. Закройте окно скорости подсчета.
Начните с измерения раствора Rhodamine 6G. После завершения измерения щелкните припадок для выполнения анализа кривой установки. Выберите модель для установки старой функции корреляции.
Для Rhodamine 6G выберите модель для 1-компонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Установите подходящее время начала, перемещая красную линию. Нажмите Fit All, чтобы начать подходящий расчет.
Проверьте пригонку отклонения. Убедитесь, что стороны размещены и отрицательные, около нуля. Проверьте установленные значения.
Убедитесь, что время диффузии примерно в диапазоне от 20-30 микросекунд. Кроме того, структурный параметр составляет от четырех до восьми. Откройте подгонку панели, и выбрать модель для измерения.
Введите то же структурное значение параметра в модели для образца в пригонка панели. Убедитесь, что тип должен быть установлен как фиксированный. Измерение GFP-TDP25 в лизации клеток.
Поместите лисат в камеру крышки. Поместите крышку, чтобы избежать высыхания лисата. Поместите крышку сцены для светлого затенения.
В панели приобретения установите мощность лазера, время измерения и его повторения. Начните приобретение. Наблюдался всплеск.
Снова наблюдался всплеск. Шип указывает на яркие молекулы, проходят через тело обнаружения. Спайки указывают на растворимые олигомеры или агрегаты.
Создайте пригонку для выполнения анализа установки кривой. Выберите модель для 2-компонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Установите подходящее время начала.
Нажмите Fit All. Проверьте установленные значения. SOD1-G85R помечены измерения GFP в живой клетке.
В отличие от измерения раствора, я рекомендую использовать инкубатор тепловой стадии. Установите клеточное блюдо на сцене микроскопа. Подтвердите фокус и положение с помощью глаз.
Выберите измерительную ячейку. Увеличьте масштаб и отрегулируйте положение ячейки с помощью режима быстрого сканирования. Приобрети снимок ячеек с помощью режима медленного сканирования.
Выберите положение измерения FCS с помощью инструмента Позиции. Перекрестие указывает на измерительное положение. Начало измерения.
Небольшое снижение записи скорости подсчета фотона говорит о фотоотводе GFP. Выполните установку кривой. Показаны репрезентативные результаты GFP-TDP25 в лизации ячеей.
Верхний график запись скорости подсчета фотона. Там, где есть стрелки шип, предлагая растворимые олигомеры и агрегаты. Средний график представляет старую функцию корреляции.
Серая линия показывает низкую, старую функцию корреляции. Пурпурная линия показывает установленную функцию. Пунктирные линии указывают время начала и конца установки.
В нижней таблице показано установленное значение. Далее показаны репрезентативные результаты SOD1-G85R-GFP в живой ячейке. Верхний график представляет собой запись нашей скорости подсчета фотона.
Наблюдалось постепенное снижение зарегистрированной скорости подсчета фотона, что свидетельствует о фотоотчете роста GFP для различных измерений. Это связано с медленной скоростью диффузии в живых клетках. Средний график представляет старую корреляционные функции SOD1.
Серая линия показывает низкую, старую функцию корреляции. Пурпурная линия показывает установленную функцию. Пунктирные линии указывают время начала и конца установки.
В нижней таблице показаны установленные значения. Здесь мы покажем вам эту процедуру для измерения диффузии от каждой ячейки, связанной TDP-25 в лицате клеток и все мутант SOD1 в живых клетках с помощью FCS. Растворимые олигомеры и агрегация в лисате клеток часто можно наблюдать как шипы или очередей.
С другой стороны, в живых клетках такие всплески наблюдаются редко, за исключением, возможно, очевидных живых структур. Медленно диффузных видов мутантов SOD1 добавить среднее яркость для отдельных частиц, таких как SOD1 гомополимеризации внутри для нас. Процедура, показанная здесь, проста и стояща.
FCS не содержит излучения; непосредственно спящее состояние. Это просто ваше и наше воображение сопереживание.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол обнаружения и анализа агрегации белков с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) как в лизатах клеток, так и в живых клетках. Метод ориентирован на склонные к агрегации белки, имеющие значение при нейродегенеративных заболеваниях, в частности TDP25, связанный с БАС, и мутантный SOD1; при этом FCS используется для оценки их диффузионных свойств и состояний агрегации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Исследования нейродегенерации
- Биофизика белков
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретические основы
- Агрегация белков является характерным признаком нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, болезни Альцгеймера, Паркинсона и Гентингтона.
- Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) позволяет обнаруживать отдельные частицы, а также анализировать их диффузию и состояния агрегации.
- Стандартизированные процедуры обнаружения агрегации методом FCS не имеют широкого распространения.
- Понимание динамики агрегации белков имеет решающее значение для выяснения механизмов развития заболеваний.
Цель исследования
- Предоставить стандартизированный протокол измерения агрегации белков в клеточных лизатах и живых клетках методом FCS.
- Продемонстрировать детектирование растворимых олигомеров и агрегатов белков, ассоциированных с БАС.
- Проанализировать диффузионные свойства склонных к агрегации белков с помощью FCS.
Используемые методы
- Культивирование и подготовка клеток Neuro2a для трансфекции и измерений.
- Трансфекция клеток конструктами TDP25 или SOD1 с GFP-меткой.
- Подготовка клеточных лизатов и образцов живых клеток для анализа методом FCS.
- Калибровка и настройка системы FCS на базе конфокального микроскопа с использованием Rhodamine 6G.
- Проведение измерений FCS в клеточных лизатах и живых клетках с последующей аппроксимацией кривых и анализом данных.
Основные результаты
- Агрегаты TDP25, меченые GFP, были обнаружены в растворимой фракции лизата клеток Neuro2a, что проявилось в виде всплесков скорости подсчета фотонов при проведении FCS.
- SOD1, меченый GFP, с мутацией, связанной с БАС, демонстрировал более медленную диффузию в живых клетках, что указывает на агрегацию или олигомеризацию.
- Всплески в данных FCS соответствовали растворимым олигомерам или агрегатам в лизате, в то время как в живых клетках наблюдалось меньше всплесков, но более медленная диффузия мутантного SOD1.
- Для обеих белковых конструкций были получены репрезентативные кривые FCS и аппроксимированные параметры.
Выводы
- Описанный протокол FCS позволяет осуществлять чувствительную детекцию и анализ агрегации белков как в лизатах, так и в живых клетках.
- Метод FCS позволяет различать мономерные и агрегированные формы белков на основании их диффузионных свойств.
- Данный стандартизированный подход способствует более широкому применению FCS в исследованиях нейродегенерации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) позволяет с высокой чувствительностью обнаруживать агрегацию белков, что является критически важным фактором в исследованиях нейродегенеративных заболеваний и на ранних этапах разработки лекарственных препаратов. Количественное измерение диффузионных свойств в клеточных лизатах и живых клетках способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней для склонных к агрегации белков. Интеграция FCS в рабочие процессы поиска новых лекарств повышает прогностическую точность и помогает при принятии решений по приоритизации портфеля программ по борьбе с нейродегенерацией.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать механизмы агрегации белков, имеющих значение для патогенеза заболеваний.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем разграничения мономерных и агрегированных форм.
- Снижает механистические риски за счет количественного анализа диффузии.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней для терапии нейродегенеративных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга агрегации.
- Обеспечивает количественные и воспроизводимые данные о состояниях агрегации белков.
- Позволяет стандартизировать анализ для оценки соединений, воздействующих на пути агрегации.
- Обеспечивает масштабируемость и повторное использование платформы для нескольких белковых мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет измерения агрегации с клеточными моделями, имеющими значение для заболевания.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации агентов, модулирующих агрегацию.
- Предоставляет скорректированные с учетом рисков данные для принятия решений о продвижении препаратов в рамках программ разработки средств лечения нейродегенерации.
- Укрепляет стратегии трансляционных биомаркеров, связывая агрегацию с функциональными исходами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод детекции агрегации на основе FCS (флуоресцентной корреляционной спектроскопии) занимает промежуточное положение между этапами раннего поиска и идентификации ведущих соединений, предоставляя ценные данные как для валидации мишеней, так и для разработки анализов в исследованиях нейродегенеративных заболеваний.
- Поиск новых биологических мишеней: количественная оценка динамики агрегации для выяснения механизмов заболевания и снижения рисков при выборе мишеней.
- Скрининг: предоставление воспроизводимых количественных показателей агрегации для отбора соединений.
- Аналитика: получение данных о диффузии и яркости для сравнения агрегации при различных условиях.
- Трансляционные исследования: согласование данных об агрегации in vitro и в живых клетках для обеспечения преемственности на доклиническом этапе.
- Корпоративное повторное использование: создание стандартизированной, многократно используемой платформы для анализа агрегации в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность в исследованиях агрегации.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые измерения агрегации.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала в портфелях препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение активов, направленных на борьбу с агрегацией.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией и анализом данных FCS.
- Необходим доступ к калиброванному оборудованию для FCS и возможностям флуоресцентного мечения.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и проведения измерений.
- Метод применим к различным склонным к агрегации белкам с соответствующими флуоресцентными метками.
- Для получения надежных результатов необходимо тщательно контролировать фотообесцвечивание и калибровку.
