Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки
30 ноября 2021 г.
Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.
Этот протокол демонстрирует простой метод генетической модификации in vitro для молекулярного исследования первичного ресничкового сигнального пути в культурах-предшественниках первичных гранул клеток. Из-за стоимости, низкой жизнеспособности и низкой эффективности метода трансформации тока мы внедряем простой, экономически эффективный и эффективный метод электропорации для исследования ресничкового сигнального пути в первичных культурах GCP. Для начала добавьте 0,5 миллилитра питательной среды в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, содержащей покрытые крышкой, и держите ее в тепле при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа.
Пипетка необходимого количества клеток в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и вращение при 200хГ в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 200 микролитрах Opti-MEM. Повторите эту процедуру дважды, чтобы убедиться, что в пробирке нет остаточной питательной среды.
Задайте параметры электропорации, как указано в списке. Пипетку реакции электропорации аккуратно перемешать, и использовать длинный наконечник пипетки Р200 для переноса точного объема в 100 микролитров смеси в двухмиллиметровый зазор кюветы. Как только кювета окажется внутри камеры кюветы, нажмите кнопку омега электропоратора и запишите значение импеданса, придерживаясь точного объема в 100 микролитров.
Диапазон значений импеданса должен быть приблизительно 30 и 35. Нажмите кнопку запуска, чтобы запустить импульс. Запишите измеренные значения тока в джоулях, показанные на кадре считывания.
Выньте кювету из камеры. Немедленно добавьте в кювету 100 микролитров предварительно подогретой питательной среды и повторно суспендируйте ее, пипеткой вверх и вниз два-три раза. Немедленно перенесите клеточную суспензию на 24-луночную пластину, предварительно подготовленную.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа. Понаблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом на следующий день. В настоящем исследовании эффективность электропорации групп, обработанных ДМСО и SAG, оказалась сопоставимой.
Иммуноокрашивание маркера первичной реснички Arl13b демонстрирует, что скорость цилиляции GCP при div-2 культуры как в транспортной, так и в SAG-обработанной группах. Скорость милиции иллюстрирует процент Pax6 экспрессирующих GCP, несущих первичную ресничку на поверхности клетки при div-2 после электропорации. На рисунке показано значительное увеличение сглаженной локализации EGFP на первичной аксонеме реснички экспрессии клеток GCP Pax6 через 24 часа после лечения SAG, что указывает на глубокую активацию первичного сигнального пути ресничкового ежа.
Для достижения более высокой эффективности электропорации следует обеспечить высокую чистоту используемой плазмиды, а в плазмидной электропорационной смеси отсутствуют остаточные питательные среды. Этот протокол должен быть непосредственно применим и полезен для экспериментов по генетической модификации in vitro на первичных культурах и типах клеток, которые трудно трансфектировать, включая нейроны и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен воспроизводимый протокол электропорации in vitro, разработанный для генетической модификации предшественников зернистых клеток мозжечка (GCPs). Основное внимание уделяется методу, который является экономически эффективным и результативным для изучения путей передачи сигналов Hedgehog, зависящих от первичной реснички.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетическая манипуляция
- Клеточная сигнализация
Теоретическая справка
- Первичные предшественники зернистых клеток мозжечка (GCPs) имеют решающее значение для изучения развития нервной системы.
- Современные методы трансфекции зачастую неэффективны и дорогостоящи.
- Первичная ресничка жизненно важна для различных сигнальных путей, включая сигнальный путь Hedgehog.
- Электропорация предлагает потенциальное решение этих проблем.
Цель исследования
- Внедрение эффективного метода электропорирования для культивирования GCP.
- Облегчение изучения сигналинга, зависимого от первичной реснички.
- Улучшение результатов генетических манипуляций в типах клеток, трудно поддающихся трансфекции.
Используемые методы
- В эксперименте использовались культуры первичных GCPs in vitro.
- Протокол электропорации включал специфические параметры для эффективной генетической модификации.
- В исследовании не упоминался мультиомный подход.
- Критически важные этапы включали ресуспендирование клеток и последовательность электропорации.
- Иммуноокрашивание использовалось для оценки частоты формирования цилий и активации сигнального пути.
Основные результаты
- Протокол продемонстрировал значительное усиление активации сигнального пути Hedgehog в обработанных клетках зернистого слоя (GCPs).
- Иммуноокрашивание выявило заметное увеличение частоты образования ресничек в GCPs после электропорации.
- Исследование позволило оценить эффективность электропорации в сравнении с традиционными методами.
- Было сделано заключение, что высокая чистота плазмиды имеет решающее значение для успеха электропорации.
Выводы
- В данном исследовании представлен ценный протокол генетических манипуляций в первичных клетках зернистых клеток области (GCPs).
- Полученные результаты расширяют понимание механизмов сигнализации, зависимых от первичных ресничек.
- В будущем данный метод может быть применен для различных типов клеток, которые трудно поддаются трансфекции.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эффективные генетические манипуляции с первичными предшественниками гранулярных клеток (GCPs) имеют решающее значение для выяснения механизмов цилиум-зависимой сигнализации, лежащих в основе нейроразвития и патологических процессов. Данный протокол электропорации обеспечивает высокую эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток, что позволяет проводить надежный анализ динамики пути Hedgehog в системах, релевантных для изучения заболеваний. Описанный метод обеспечивает прогностическую достоверность на этапах предварительного поиска и валидации мишеней для модуляторов сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность функционального генетического анализа цилиум-зависимого сигнального пути Hedgehog в первичных GCP.
- Способствует снижению механистических рисков, позволяя напрямую визуализировать локализацию компонентов пути.
- Облегчает валидацию мишеней посредством воспроизводимого манипулирования узлами передачи сигнала в клетках, имеющих значение для патогенеза заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы первичных клеток для последующего скрининга модуляторов сигнальных путей.
- Обеспечивает высокую эффективность трансфекции (~80-90%) и воспроизводимость результатов количественного анализа.
- Обеспечивает масштабируемую и экономически эффективную разработку анализа для труднотрансфицируемых нейрональных моделей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты in vitro с клеточными фенотипами, имеющими значение для заболевания, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Способствует поиску биомаркеров, обеспечивая динамическое отслеживание локализации сигнальных белков.
- Снижает биологические риски при доклиническом продвижении за счет предоставления надежных механистических данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол применим на ранних этапах поиска и валидации мишеней, обеспечивая связь между генетическими манипуляциями и количественным анализом сигнальных путей в первичных нейронных системах.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей в первичных GCP.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую высокоэффективную трансфекцию для подготовки анализов и получения количественных данных.
- Аналитика: позволяет измерять частоту цилиации и активацию путей с помощью иммуноокрашивания и флуоресцентной микроскопии.
- Трансляционные исследования: связывает механистические данные, полученные in vitro, с клеточным контекстом соответствующих заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предлагает широко применимую платформу для генетической модификации сложных типов первичных клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность в исследованиях сигнальных путей.
- Операционная ценность: стандартизирует генетические манипуляции с высокой воспроизводимостью и масштабируемостью.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения надежных данных на ранних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней и модуляторов сигнальных путей с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами нейронов и методами электропорации.
- Необходим доступ к оборудованию для электропорации и флуоресцентной микроскопии для проведения анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация чистоты плазмид и протоколов удаления среды.
- При оптимизации протокола метод применим и к другим труднотрансфицируемым типам первичных клеток.
- Эффективность зависит от точного контроля параметров электропорации и подготовки образцов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
