Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Здравствуйте, меня зовут Мэтт Луи. Я postdoctoral fellow в лаборатории Лесли Сол в Университете Рокфеллера. Сегодня я хотел бы рассказать вам об экспериментах, которые мы проводим для изучения хемотаксиса личинок.

Проблема, которая нас интересует, довольно проста. Она фактически представлена здесь, в данной установке. Я только что перенес группу личинок Joseph на эту поверхность агарозы.

Эта среда довольно враждебна, и животные находятся на грани голодания. Каким-то образом этим животным нужно будет найти путь к ближайшему источнику пищи; здесь есть бананы, выделяющие запах, который привлечет личинок. Данная среда не является идеальной для изучения поведения хемотаксиса, поэтому первым улучшением станет замена банана химическим веществом.

Данное химическое вещество представляет собой изоацетат, который является одним из преобладающих ароматических компонентов банана. Таким образом, мы используем этот искусственный ароматизатор, что позволяет нам гораздо точнее контролировать ольфакторный стимул. Следующим улучшением является использование закрытой среды, чтобы попытаться предотвратить колебания в распределении вещества.

Вот анализ, который мы используем в лаборатории уже довольно долгое время. Перед нами чашка Петри с агаром на дне. Агар идеально подходит для хемотаксиса личинок, так как он поддерживает их увлажненными.

По обеим сторонам планшета расположены крышки из тефлона; сейчас мы внесем изоамилацетат на одну сторону и оставим другую сторону пустой. После этого чашку Петри закрывают, выдерживают некоторое время для диффузии вещества, а затем открывают. Затем помещают в чашку животное и позволяют ему перемещаться в течение определенного периода времени.

Данный анализ основан на предположении о том, что при введении theodor с одного края чашки создается градиент, который устанавливается достаточно быстро и остается стабильным в течение всего периода теста. Основная проблема заключается в том, что существование такого градиента в чашке еще никто не демонстрировал. Вполне возможно, что вскоре после добавления theodor в чашке возникает его гомогенное распределение, при котором градиент становится очень пологим, или же для установления градиента требуется несколько минут.

Это, конечно, будет зависеть главным образом от давления паров используемого теодора. Второй вопрос касается того, что именно количественно оценивается в ходе эксперимента. Представьте, что животное начинает движение отсюда, от X, и спустя три минуты оказывается у этой концевой пластины, отмеченной красным X. В таком случае возможны два подхода.

Одним из вариантов может быть запись только конечного положения животного по истечении определенного периода времени, например, трех или пяти минут. В таком случае вы зафиксируете только начальное и конечное положение, однако мы полагаем, что важно иметь хорошее разрешение данных о поведении животного во времени. Например, животное могло почти не сдвинуться с начальной позиции к конечной, как в данном случае, или же оно могло провести значительную часть времени в области вокруг точки, прежде чем вернуться в нее до окончания испытания.

Выводы, которые мы можем сделать из этих двух ситуаций, будут совершенно разными. В одном случае животное могло не отреагировать на стимул, в то время как в другом случае оно определенно отреагировало. Первое из двух улучшений, которых мы стремимся достичь, заключается в контроле формы и стабильности другого градиента в арене.

Во-вторых, отслеживайте поведение животного в режиме реального времени и сохраняйте всю полученную информацию. В следующем блоке Сильвия продемонстрирует, как мы готовим серийные разведения. Меня зовут S ti.

Я работаю научным сотрудником в лаборатории VAs под руководством материала lui. Сегодня я покажу вам, как подготовить материалы для системы камер, которую мы используем для отслеживания животных. Основная особенность нашей системы камер заключается в том, что мы используем запахи, распределенные в воздухе.

Это означает, что, например, если используемые чашки с агаром не плоские, могут возникнуть колебания концентрации между экспериментами, что приведет к появлению шума в системе. Поэтому я покажу вам и дам несколько небольших советов, как попытаться уменьшить шум в системе. Материалы для приготовления разведения запаха: стеклянная банка, предпочтительно из затемненного стекла, если вы используете светочувствительные вещества, и аликвота интересующего вас запаха.

Стеклянные пипетки для подготовки данной аликвоты и подходящий механический дозатор для пипеток. Затем наконечники для парафинового масла, стандартный автоматический дозатор и маленькие флаконы для разведения. Последние должны быть стеклянными и желательно из темного стекла, а также весы для обеспечения точности измерений и снижения погрешности между экспериментами.

Поскольку запахи характеризуются высокой летучестью, а некоторые из них токсичны, все манипуляции проводятся в вытяжном шкафу. Первым шагом при подготовке разведения запаха является аликвотирование исходного вещества. Для обеспечения точности разведений и минимизации вариативности между экспериментами необходимо всё взвешивать.

Для начала сделайте маркировку; мы будем готовить раствор этилбутирата с концентрацией 1 M. Сначала подготовьте парафиновое масло. Парафиновое масло очень вязкое, поэтому важно погружать наконечник дозатора в масло минимально — ровно настолько, чтобы можно было отобрать масло, не создавая пузырьков.

Затем рекомендуется вытереть излишки парафинового масла со стенок флакона. Повторим: поскольку парафиновое масло обладает высокой вязкостью, очень важно медленно вводить его в виалу. После того как вы перенесли парафиновое масло во флакон, не выбрасывайте наконечник сразу, так как в его нижней части может остаться еще некоторое количество вещества.

Перед началом разведения рекомендуется подготовить расчетный лист, в котором будут заранее рассчитаны объем и вес добавляемого парафинового масла, а также вес соответствующего ароматизатора. Это позволит вам с помощью весов проверить, достаточно ли у вас всего необходимого парафинового масла и ароматизатора. При необходимости доливайте парафиновое масло и проводите повторное взвешивание до достижения нужного значения.

Как только вы определите правильный вес базового масла, вам останется только добавить одорант, используя те же принципы. Хорошо. Теперь я покажу, как подготовить личинок для трекинга.

Обычно мы используем личинок шестидневного возраста. Это связано с тем, что они достаточно велики для легкого распознавания нашим программным обеспечением и при этом остаются очень активными. Чтобы определить, не слишком ли стары личинки для использования в трекинге, достаточно проверить, нет ли среди них особей, ползающих по стенкам. Если личинки ползают по стенкам, значит, они слишком стары и не будут проявлять достаточной активности.

Первым этапом подготовки личинок является их погружение в 15% sucrose. 15% sucrose используется для того, чтобы личинки плавали в этом растворе, в то время как корм будет либо частично растворяться в нем, либо оседать на дно. Налейте достаточное количество sucrose, чтобы до верхнего края флакона или пробирки оставалось чуть менее одного дюйма.

Затем возьмите шпатель. Вы уже можете видеть всплывающих личинок; осторожно перемешайте корм, чтобы извлечь животных, зарывшихся в него, слегка закрутите содержимое, чтобы отделить их от корма, и оставьте на несколько минут. Как только корм и личинки достаточно разделятся, возьмите заранее промаркированную чашку Петри и перелейте их в более глубокую часть.

Сохраните крышку чашки Петри, так как вы наполните ее водой и будете использовать в качестве емкости для отслеживаемых личинок, чтобы отделять тех, кого вы уже отследили, от остальных. После того как вы перенесли личинок в чашку Петри, необходимо подождать 30 минут, чтобы они адаптировались к сахарозе и достигли состояния голодания. Это обеспечит более правильное поведение личинок в установке для трекинга по истечении этих 30 минут адаптации.

Время обработки сахарозой — подходящий момент для подготовки планшетов для трекинга. Перед нами крышки 96-луночных планшетов. Их можно приобрести отдельно; здесь представлен 3% раствор агарозы, который был предварительно нагрет.

Мы используем 3%, так как эта концентрация препятствует зарыванию личинок, но при этом гель достаточно плотный, чтобы они могли по нему передвигаться, и он остается увлажненным на поверхности каждой чашки. Необходимо пипетировать 25 мл агарозы. Важно постараться избежать образования крупных пузырьков воздуха в геле.

Также важно поместить планшеты на ровную поверхность, иначе гели могут получиться наклонными, что может повлиять на поведение личинок. После застывания гелей мы складываем крышки друг на друга и оборачиваем их пищевой пленкой, чтобы предотвратить их высыхание. Это позволит сохранить их в надлежащем состоянии для отслеживания в течение нескольких дней.

В данной серии я представлю вам наш поведенческий анализ, который немного отличается от анализа в чашках Петри, о котором я рассказывал ранее. Вам понадобятся планшеты с 96 лунками, а также планшеты, содержащие агаровый слой. Анализ состоит из трех крышек, которые расположены друг над другом.

Первый слой пуст и используется исключительно для изоляции системы от поверхности, на которой она находится. Второй слой содержит поверхность Diego agro. Животных помещают на эту поверхность, и теперь, как я покажу далее, мы вводим theodor в планшет.

Важно использовать новую чистую крышку при каждой загрузке theodor. Это необходимо для предотвращения перекрестного загрязнения между экспериментами. Вам также потребуется другой раствор для разведения.

Обычно мы не используем краситель для загрузки тетра-О-метилглюкозы, но здесь я воспользуюсь им для наглядности. Это раствор тетра-О-метилглюкозы высокой концентрации. А этот сильно разбавлен; моя цель — создать градиент вдоль линии.

Произнесите эту фразу; мы хотим, чтобы концентрация увеличивалась слева направо. Для этого я буду использовать несколько капель реагента, помещенных в конденсационное кольцо с возрастающей концентрацией. Я начну с самой высокой концентрации, которую помещу на край.

Важно равномерно распределить препарат по кольцу. Теперь я перехожу к следующей концентрации, которая разведена в два раза по сравнению с первой, и наношу ее в это кольцо. Таким образом, у меня получается шесть капель.

В первой пробирке концентрация составляет, скажем, 1. Во второй концентрация равна 0.5, что в два раза меньше, чем в первой. В третьей концентрация составляет 0.25, и так далее.

Таким образом, мы получаем геометрический ряд вдоль линии. Следующий шаг заключается в переворачивании этой крышки на поверхности AAL, и теперь за счет поверхностного натяжения все капли остаются подвешенными к верхней части крышки. Мы разработали метод на основе инфракрасной спектроскопии для измерения всей концентрации в планшете.

Применяя этот метод, мы смогли показать, что если создать геометрическую прогрессию вдоль линии подачи одоранта, то в результате получается концентрация одоранта вдоль длины, которая увеличивается экспоненциально, как показано здесь, а по ширине пластинки мы наблюдаем профиль с пиком точно под линией подачи одоранта. Здесь представлен вид фактической геометрии градиента.

Что касается концентрации теодора в воздухе, положительным моментом является то, что нам удалось показать стабильность геометрии градиента в течение как минимум 15 минут. После установки верхней крышки мы выжидаем 30 секунд для установления градиента. Затем мы помещаем животное в арену.

Животное помещают под линию другого конца между третьей и четвертой позициями; для переноса личинок из раствора сахарозы на поверхность агара мы используем маленькую булавку. Перенос осуществляется путем захвата личинки головкой булавки. Мы быстро открываем крышку и помещаем личинку на поверхность агара.

Затем закрываем крышку. Важно свести к минимуму время, в течение которого крышка остается открытой. Далее следует запись движений животного в течение трех или пяти минут.

Производится непосредственная запись. В данной установке для трекинга камера подключена к компьютеру. Для сбора данных о движениях животного и их сохранения в виде цифрового файла мы используем программное обеспечение для трекинга изображений Aton vision от компании Nordis.

Теперь мы приступаем к поведенческому эксперименту. У нас есть крышка с слоем аро и серии разведений.

Диего застрял на первой крышке. Перед загрузкой теодора важно перемешать каждую пробирку на вортексе. Мы используем наши разведения, где самое низкое находится слева, а самое высокое — здесь, справа.

Все шесть капель наносятся на планшет одновременно. Чтобы избежать потерь летучих компонентов запаха, здесь используется многоканальный дозатор: из каждого образца разведения берется по 10 µL вещества, которое затем одновременно переносится на поверхность. После нанесения крышка переворачивается и прижимается к поверхности агароза.

Градиент в планшете был создан в течение последних 30 секунд, как я показывал вам ранее. Теперь я помещу животное на поверхность Диего. Сразу после помещения животного я начну запись.

Животное находится здесь, и в данный момент осуществляется отслеживание его перемещений. Как видно, животное движется вдоль линии одоранта в направлении точки с наивысшей концентрацией градиента. Помните, что концентрация увеличивается слева направо по экспоненте.

Как видно, направление движения постоянно корректируется. Относительно стимула животное достигло точки максимальной концентрации градиента, после чего мы удаляем его с планшета. Животное перемещают на другой планшет, чтобы исключить повторное отслеживание одной и той же особи подряд.

После введения новой личинки и начала новой записи мы придерживаемся следующих правил отслеживания. Мы прекращаем отслеживание, как только животное достигает ряда планшета с максимальной концентрацией, который соответствует этому и вот этому ряду. Кроме того, если животное ударяется о стенку, отслеживание прерывается, так как мы хотим избежать любых помех.

Первый вопрос, который мы рассматривали, был довольно простым. Мы хотели выяснить, может ли животное чувствовать запах при определенной концентрации. Чтобы провести такой тест, мы обычно используем один источник запаха вместо нескольких.

Это позволяет варьировать концентрацию в капле Теодора, имея одну степень свободы. Здесь, например, представлена капля с высокой концентрацией, а здесь — капля с низкой концентрацией. Обычно мы помещаем животное на поверхность Диего непосредственно под каплей Теодора, чтобы определить, способно ли животное обнаружить ее присутствие и остаться в ее окрестностях.

Теперь я хотел бы продемонстрировать более продвинутое применение нашего анализа. Представьте, что у вас есть одна капля с определенным порядком, и вы записываете несколько траекторий, которые наложены друг на друга; здесь их три. Одна из особей оставляет за собой этот зеленый след.

Здесь видна оранжевая траектория, которая смещена от центра, и розовая траектория, представляющая животное, которое, по-видимому, кружит вокруг источника. Мы полагаем, что детальный анализ траекторий может дать много важной информации. По этой причине мы импортируем траекторию в Matlab как серию координат положений и проводим дальнейший анализ с помощью Matlab.

Ниже представлено расстояние до источника, вероятно, в зависимости от времени. Из трех траекторий, показанных ранее, зеленая траектория остается очень близкой к источнику. Оранжевая траектория характеризуется значительно более высоким уровнем шума.

Затем видна эта фиолетовая траектория; интересно, что она показала: животное удалилось от источника, чтобы остаться на определенном расстоянии, что, вероятно, соответствовало оптимальной концентрации. Здесь представлена иллюстрация 10 траекторий животных, которые не способны чувствовать запах. Это мутанты или мутанты three B, которые не являются ольфакторами.

Как видно, все эти траектории показывают, что животные не смогли обнаружить источник запаха и просто удалились от него. В резком контрасте с этим, здесь мы записали 10 последовательных траекторий животных дикого типа. Эти животные, разумеется, способны чувствовать запах, и, как видно, все они скапливаются непосредственно под источником дезодоранта.

Представленные выше 20 траекторий были фактически получены без предварительного знания о принадлежности животных. Это демонстрирует эффективность и надежность нашего метода. Чтобы определить, способны ли мутанты чувствовать запах в условиях экспоненциального градиента, мы записываем несколько треков, чтобы оценить, насколько хорошо животные способны следовать к источнику стимула на другом конце.

Сейчас я продемонстрирую вам 15 траекторий, записанных по отдельности; как видите, животные отлично справляются с тем, чтобы следовать за стимулом к противоположной линии. Теперь мы перейдем к простому контролю. Вполне возможно, что животные в экспоненциальном градиенте следовали вдоль линии просто потому, что присутствовал какой-либо стимул независимо от его концентрации, и животные просто двигались прямо.

Таким образом, чтобы показать, что они действительно вычисляют концентрацию или какой-то связанный с ней параметр и используют его для управления своим движением, мы подготовили данную геометрию, напоминающую двускатную крышу. Личинку вводят сюда, как обычно; мы ожидаем, что она будет двигаться вдоль линии, затем обнаружит, что после этой точки концентрация снижается, и вернется назад. Данный тест был проведен с пятью животными.

Мы собрали траектории и теперь представляем их, наложенными на этот слайд. Как видно, животные стартовали отсюда, двигались вдоль линии, затем исследовали область, соответствующую самой высокой концентрации, и в основном оставались там. Это убедительно свидетельствует о том, что они способны вычислять градиент концентрации в реальном времени, используя метод с одним источником.

Нам удалось ответить главным образом на один важный вопрос: может ли животное обнаружить запах при определенной концентрации с помощью многоисточникового устройства? Мы обладаем большей гибкостью в изменении формы градиента и определении того, способно ли животное использовать эту информацию.

Я хотел бы проиллюстрировать эту идею, проведя простой эксперимент. В созданных нами до этого градиентах вдоль линзы наблюдалась экспоненциальная форма. Теперь вопрос в том, если мы усложним задачу, сделав увеличение концентрации вдоль линзы линейным, смогут ли они по-прежнему найти путь к противоположной конечной линии?

На этом графике представлены два типа градиента. Мы протестировали экспоненциальный градиент (фиолетовым цветом) и линейный градиент (зеленым цветом). Это линейный градиент, и я укажу различные концентрации ацетата изама при разведении в родительском масле.

Это арифметическая прогрессия. Мы создаем линейный градиент, и, как видно, его наклон довольно пологий по сравнению с экспоненциальным градиентом, где концентрация на краях также составляет 0.5, но возрастает до 0.03. Вопрос в том, способны ли navi к хемотаксису при таком пологом градиенте?

Здесь представлена фактическая концентрация ацетата, использованная в шести каплях для экспоненциального и линейного градиентов. Как видно, хотя максимальные концентрации в обоих случаях одинаковы, минимальная концентрация для линейного градиента здесь довольно высока. Мы провели эксперимент с линейным градиентом; здесь представлены 15 траекторий животных дикого типа, и, по нашему мнению, вполне очевидно, что эти животные смогли обнаружить линейный градиент и следовать этому сигналу вдоль линии градиента.

Итак, я полагаю, наша позиция ясна. Прежде чем закончить, я хотел бы кратко рассказать о перспективах развития данной установки для трекинга. Хотя эта система позволяет реализовать множество интересных задач — например, наблюдение за сложным поведением личинок в течение более длительного времени и на большей площади, — у нее есть определенные ограничения.

Например, вы ограничены размером планшета, что накладывает лимиты на продолжительность отслеживания и сложность изучаемого поведения. Поэтому было бы полезно разработать систему, в которой планшет был бы больше или в которой границы планшета вообще не были бы ограничением. Другая проблема заключается в том, что с имеющимся у нас программным обеспечением сложно одновременно отслеживать более одного животного, поэтому наблюдение за поведением популяции в режиме реального времени невозможно.

Еще одним интересным аспектом поведения, который мы не можем проверить с помощью данной установки, являются фактические трехмерные перемещения личинок в пространстве. При отслеживании животных вы заметите, что, например, достигая капли с запахом, они могут приподнимать голову или водить ею из стороны в сторону, пытаясь обнаружить изменения концентрации. Вероятно, в настоящее время это невозможно реализовать с помощью нашей конкретной установки, поэтому было бы полезно разработать решение, которое позволило бы нам это сделать.