Визуализация кальция в Верхнем колликулусе мышей
21 апреля 2023 г.
В этом протоколе подробно описана процедура визуализации кальциевых ответов в верхнем бугорке (СК) бодрствующих мышей, включая визуализацию активности одного нейрона с помощью двухфотонной микроскопии с оставлением коры нетронутой у мышей дикого типа, а также визуализацию всей СК с помощью широкопольной микроскопии у мутантных мышей с частичной корой.
Мои исследования сосредоточены на нейронном кодировании и механизмах обработки визуальной информации. Мы пытаемся ответить на вопрос о том, как различная информация кодируется в мозге, особенно в верхнем колликулусе, в соответствии с лежащими в его основе нейромеханизмами. Чтобы понять визуальную обработку, ученые комбинируют различные подходы, в том числе морфологию нейронов, антеградную и ретроградную трассировку, секвенирование IL, нейромоделирование, машинное обучение.
Задача состоит в том, чтобы удалить череп над SSA, разрезав и оставив в кости один больший кусок, скорее всего, не удастся, потому что кость прикреплена к твердой мозговой оболочке. Объединив две фотографии на широкопольном кальциевом изображении, наша недавняя работа выявила архитектуру функции направления движения в мыши SC как при разрешении одной ячейки, так и в глобальном масштабе. Мы обнаружили, что нейроны со схожими предпочтениями образуют участки длиной до 500 мкм под глобальным вверх при носовом движении.
С помощью нашего протокола мы устраняем два пробела в исследованиях. Во-первых, исследователи могут выполнять долговременную гипсовую визуализацию в мышиной СК с разрешением одной клетки, не нарушая кору головного мозга. Во-вторых, исследователи могут регистрировать нейроактивность по всей СК с помощью широкопольного микроскопирования.
Наш протокол позволяет визуализировать заднюю медиальную СК с разрешением одной клетки с интактной корой головного мозга у мышей. Кроме того, мы используем биосовместимую пробку для обнажения SC, что снижает инфекцию при хронической визуализации. Наши результаты позволяют изучить нейронное кодирование визуальной информации в большом поле зрения.
В сочетании с оптогенетикой можно изучать половину входных сигналов из разных областей мозга, модулирующих нейроактивность при СК.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол визуализации кальциевых ответов в верхнем холмике (SC) у бодрствующих мышей с использованием двухфотонной микроскопии для регистрации активности отдельных нейронов при сохранении коры у мышей дикого типа, а также широкопольной микроскопии для всего SC у мутантных мышей с частичным отсутствием коры.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Методы визуализации
- Зрительная обработка
Теоретические сведения
- Верхнее двухолмие играет ключевую роль в обработке зрительной информации.
- Понимание нейронного кодирования в верхнем двухолмии необходимо для выяснения механизмов зрительного восприятия.
- Предыдущие методы визуализации могли нарушать целостность коры, что затрудняло проведение долгосрочных регистрационных исследований.
- Данный протокол направлен на решение этих проблем, предлагая минимально инвазивный подход к визуализации.
Цель исследования
- Разработать надежный метод долгосрочного кальциевого имиджинга в верхней двухолмие (SC) мыши.
- Обеспечить возможность регистрации нейронной активности во всем SC без повреждения коры головного мозга.
- Углубить понимание того, как визуальная информация представлена на уровне нейронов в SC.
Используемые методы
- В исследовании используются методы двухфотонной и широкопольной микроскопии.
- Используются модели мышей дикого типа и мутантные модели; для регистрации кальциевых сигналов применяется аденоассоциированный вирус для экспрессии GCaMP6m.
- Основные методики включают имплантацию головной пластины, хирургический доступ для обнажения спинного мозга (SC) и использование присоски для хронической визуализации.
- После вирусной инъекции перед началом визуализации соблюдается период восстановления продолжительностью три недели.
- Подробные этапы хирургического вмешательства обеспечивают минимальное повреждение окружающих тканей.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет детально изучить активность нейронов, связанную с предпочтениями направления движения в верхней холмике (SC).
- Результаты показывают, что нейроны со схожими предпочтениями могут группироваться в кластеры, что влияет на обработку визуальных сигналов на обширных областях.
- Возможна хроническая визуализация при сохранении целостности коры, что облегчает проведение продолжительных исследований нейронной динамики.
- Сочетание данных визуализации с оптогенетикой позволяет исследовать модулирующие воздействия из других областей мозга.
Выводы
- Данное исследование устанавливает надежный метод анализа кальциевой сигнализации в SC, внося значительный вклад в понимание механизмов зрительного восприятия.
- Описанные методы визуализации открывают перспективы для развития лонгитюдных исследований нейронной активности у животных в состоянии бодрствования.
- Подобные методологии расширят возможности изучения нейронных механизмов и их влияния на зрительное поведение и нарушения зрения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Кальциевый имиджинг высокого разрешения в верхнем холмике (SC) мыши позволяет напрямую исследовать нейронное кодирование, лежащее в основе зрительного восприятия, что способствует механистическому снижению рисков на этапе валидации мишени. Возможность регистрации активности как отдельных клеток, так и структуры в целом у бодрствующих животных обеспечивает прогностическую уверенность для портфелей в области трансляционной нейробиологии и нейрофармацевтики. Такой двухмасштабный подход укрепляет решения на ранних этапах поиска и дает информацию для последующей разработки анализов для мишеней зрительной системы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональное картирование цепей визуальной обработки на клеточном и сетевом уровнях.
- Способствует снижению рисков при изучении механизмов, позволяя различать унаследованное и возникшее de novo нейронное кодирование в SC.
- Предоставляет количественные данные о нейронной активности для обоснования выбора и валидации мишеней.
- Облегчает проверку гипотез относительно кодирования визуальных признаков в системах, имеющих значение для патологических процессов.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать валидированные платформы визуализации для воспроизводимого измерения нейрональных ответов.
- Обеспечивает получение количественных, масштабируемых данных, подходящих для скрининга соединений в моделях зрительного пути.
- Обеспечивает стандартизацию условий анализа для сопоставимости результатов между различными исследованиями и группами.
- Способствует разработке надежных методов фенотипического скрининга нейроактивных соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет показатели нейронной активности с трансляционными биомаркерами зрительной функции.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска нейронного кодирования до доклинической валидации методов воздействия на зрительную систему.
- Позволяет осуществлять с учетом рисков продвижение мишеней зрительного пути на основе функциональных данных in vivo.
- Поддерживает механистические исследования модуляции нейронных цепей с использованием оптогенетической интеграции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол визуализации связывает этап предварительного поиска и доклинические исследования, позволяя проверять гипотезы, уточнять сигнальные пути и проводить количественный анализ в SC. Он предназначен для интеграции на всех этапах: от валидации мишени до идентификации перспективных соединений и трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: позволяет проводить прямое измерение нейронного кодирования и функций проводящих путей в верхнем двухолмии (SC).
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для разработки методов анализа и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет высококонтентные данные о нейронной активности, позволяя проводить статистическое сравнение экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает нейронную активность in vivo с потенциальными биомаркерами расстройств зрительной системы.
- Корпоративное повторное использование: предлагает многократную платформу визуализации, адаптируемую к другим областям мозга и исследовательским задачам.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и снижает механистическую неопределенность в исследованиях процессов зрительного восприятия.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости исследований.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения надежных функциональных данных на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней зрительной системы с учетом рисков и обосновывать решения о дальнейшем продвижении проектов количественными доказательствами.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в области визуализации in vivo, хирургической подготовки и анализа данных.
- Необходим доступ к платформам двухфотонной и широкопольной микроскопии, а также к соответствующей вспомогательной инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация процедур обращения с животными, введения вирусных векторов и протоколов визуализации.
- Методика может быть адаптирована для других областей мозга путем модификации протокола, в соответствии с исходными данными.
- Долгосрочная стабильность визуализации и точное таргетирование являются важными практическими аспектами для проведения хронических исследований.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
