Мультиплексная иммунофлюоресценция в сочетании с анализом пространственных изображений для клинико-биологической оценки микроокружения опухоли
2 июня 2023 г.
В данной статье описан протокол ручного усиления тирамидного сигнала (TSA) мультиплексной иммунофлуоресценции (mIF) в сочетании с анализом изображений и пространственным анализом. Этот протокол может быть использован с фиксированными формалином парафиновыми срезами (FFPE) для окрашивания от двух до шести антигенов на предметное стекло в зависимости от сканера предметного стекла, доступного в лаборатории.
В нашей лаборатории мы изучаем колоректальный рак человека. Его прогрессирование до метастатического заболевания и его реакция на лечение, включая иммунотерапию. Мы пытаемся найти новые прогностические и прогностические биомаркеры, исследуя иммунное микроокружение опухоли и внутриопухолевый микробиом при первичном и метастатическом заболевании.
В нашем проекте в настоящее время мы внедряем несколько технологий, таких как секвенирование РНК, секвенирование всего экзома, секвенирование TCR, анализ циркулирующей бесклеточной ДНК, иммунофлуоресценция и гибридизация института флуоресценции. На данный момент наша основная задача состоит в том, чтобы объединить гибридизационное окрашивание института флуоресценции с мультиплексной иммунофлуоресценцией амплификации сигнала тирамида для изучения взаимодействия между микробиомом и иммунными клетками. Наш метод надежен, воспроизводим, прост в использовании и экономичен.
Он может быть установлен в любой лаборатории, имеющей сканер флуоресцентного света, плюс метод может быть использован с любым коммерчески доступным антителом IHC в отличие от коммерчески доступных наборов, которые обычно оптимизированы для ограниченной панели антигенов.
Обзор
В данной статье описывается протокол ручного усиления сигнала тирамидом (TSA) для мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания (mIF) в сочетании с анализом изображений и пространственным анализом. Метод применим к срезам тканей, фиксированным в формалине и залитым парафином (FFPE), для окрашивания нескольких антигенов на одном предметном стекле.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Патология
Теоретическая часть
- Исследование колоректального рака у человека и механизмов его прогрессирования.
- Изучение иммунного микроокружения опухоли и внутриопухолевого микробиома.
- Применение различных технологий, включая секвенирование РНК и иммунофлуоресценцию.
- Трудности при сочетании различных методов окрашивания для проведения комплексного анализа.
Цель исследования
- Поиск новых прогностических и предиктивных биомаркеров.
- Изучение взаимодействия между микробиомом и иммунными клетками.
- Разработка надежного и воспроизводимого метода окрашивания.
Используемые методы
- Ручное усиление сигнала тирамидом при мультиплексной иммунофлуоресценции.
- Анализ изображений с использованием алгоритмов многоцветной флуоресценции.
- Флуоресцентная гибридизация in situ в сочетании с иммунофлуоресценцией.
- Подробный протокол окрашивания срезов тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE).
Основные результаты
- Успешное окрашивание нескольких антигенов на одном предметном стекле.
- Оптимизация специфичности антител и соотношения сигнал/шум.
- Эффективный анализ изображений, позволяющий получить количественные данные.
- Демонстрация применимости метода в различных лабораториях.
Выводы
- Метод TSA mIF универсален и экономически выгоден.
- Его можно адаптировать для различных антител и антигенов.
- Данный подход расширяет понимание биологии опухолей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ (mIF) с пространственным анализом изображений позволяет проводить высококонтентное количественное картирование микроокружения опухоли (TME), что способствует поиску биомаркеров и снижению механистических рисков в онкологических разработках. Данный рабочий процесс предоставляет практически значимую информацию о взаимодействиях иммунных и стромальных клеток, что служит основой для стратегий по поиску прогностических биомаркеров и трансляционных исследований. Воспроизводимость метода и его совместимость с различными антителами делают его масштабируемым инструментом для онкологических исследований и разработок корпоративного уровня.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Обеспечивает пространственно-разрешенный анализ взаимодействий иммунных и опухолевых клеток для валидации мишеней.
- Позволяет снизить риски при изучении механизмов за счет количественного определения плотности и близости клеток определенных типов в различных компартментах опухоли.
- Способствует выявлению новых прогностических и предиктивных биомаркеров для приоритизации портфеля препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные тканевые системы для последующего мультиплексного скрининга биомаркеров.
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых и количественных пространственных данных для разработки анализа.
- Позволяет проводить надежную оценку специфичности антител и оптимизацию соотношения сигнал/шум для обеспечения готовности к скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласовывает пространственный анализ биомаркеров с моделями, релевантными заболеванию, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем установления связи между характеристиками TME и гипотезами терапевтического ответа.
- Предоставляет количественные данные для сравнения различных исследований и когорт в рамках доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс mIF и пространственного анализа связывает этапы раннего поиска, валидации биомаркеров и трансляционных исследований в рамках онкологических портфелей.
- Фундаментальная биология: Количественная оценка распределения иммунных и стромальных клеток для выяснения механизмов, определяемых микроокружением опухоли (TME).
- Скрининг: Стандартизация мультиплексных анализов тканей для получения воспроизводимых количественных результатов.
- Аналитика: Экспорт пространственных данных и данных о плотности для статистического сравнения отделов опухоли и клеточных взаимодействий.
- Трансляционные исследования: Связывание пространственных паттернов биомаркеров с терапевтическим ответом для обеспечения преемственности между доклиническими и клиническими исследованиями.
- Корпоративное использование: Возможность адаптации под любую панель антител и тип опухоли, что позволяет применять метод для широкого спектра исследовательских портфелей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при выборе биомаркеров и мишеней за счет разрешения пространственных взаимодействий клеток.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимый, масштабируемый и экономически эффективный мультиплексный анализ тканей.
- Стратегическая ценность: обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних этапах за счет надежной характеристики TME.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию онкологических активов с учетом рисков на основе пространственных доказательств наличия биомаркеров.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы в области иммунофлуоресценции, анализа изображений и статистической обработки данных.
- Необходим доступ к флуоресцентному сканеру предметных стекол и совместимому программному обеспечению для анализа изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов валидации антител и окрашивания.
- Метод применим для различных типов опухолей и панелей антител при условии соответствующей оптимизации.
- Для получения надежных результатов необходима строгая специфичность антител и оптимизация соотношения сигнал/шум.
