Простое создание васкуляризированной остеогенной ниши костного мозга с использованием предварительно изготовленных гидрогелей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) в микропланшете для визуализации
19 мая 2023 г.
Модель сосудистой ниши костного мозга in vitro создается путем посева мезенхимальных и эндотелиальных клеток на предварительно отлитые 3D-гидрогели ПЭГ. Эндотелиальные сети, компоненты ECM и активность ALP в нишах варьируются в зависимости от используемого фактора роста. Платформа может быть использована для продвинутых моделей рака.
В большинстве исследований васкуляризации in vitro используются матрицы естественного происхождения. Несмотря на то, что они, как правило, очень чувствительны к биологическим процессам, присущая им биологическая активность усложняет изучение влияний отдельных параметров. Здесь мы можем выборочно добавлять интересующих нас игроков и оценивать, как меняется система.
Последовательный посев клеток на наших синтетических гидрогелях из чистого листа позволяет формировать четко определенные ниши. Здесь hBMMS колонизируют гидрогели и откладывают присущий им внеклеточный матрикс. Это обеспечивает субстрат для впоследствии засеянных эндотелиальных клеток.
Эта функция обычно не встречается в других 3D-моделях in vitro. Возможность последовательного добавления различных типов клеток позволяет создавать высокопроизводительные совместимые модели in vitro с большой сложностью. Эти модели могут быть адаптированы для создания более специфических остеогенных васкуляризированных ниш и для исследования функций клеточных и молекулярных игроков.
Обзор
В данном исследовании создается модель сосудистой ниши костного мозга in vitro с использованием трехмерных ПЭГ-гидрогелей. Модель позволяет осуществлять последовательный посев мезенхимальных и эндотелиальных клеток, что дает возможность изучить клеточные взаимодействия и влияние факторов роста на развитие ниши.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Тканевая инженерия
Теоретические основы
- Традиционные модели in vitro часто используют матрицы природного происхождения, что затрудняет изучение конкретных параметров.
- Синтетические гидрогели обеспечивают контролируемую среду для посева клеток.
- Последовательное добавление клеток позволяет создавать сложные модели, совместимые с высокопроизводительным скринингом.
- Данные модели могут быть адаптированы для изучения остеогенных васкуляризированных ниш.
Цель исследования
- Разработать синтетическую модель in vitro для изучения сосудистых ниш костного мозга.
- Оценить влияние различных факторов роста на формирование эндотелиальной сети.
- Обеспечить возможность проведения высокопроизводительных экспериментов с определенными клеточными взаимодействиями.
Используемые методы
- Посев hBM-MSCs и GFP-HUVECs на ПЭГ-гидрогели.
- Мониторинг развития клеточной культуры с помощью микроскопии в светлом поле и флуоресцентной микроскопии.
- Количественное определение параметров эндотелиальной сети с помощью анализа в ImageJ.
- Оценка влияния факторов роста на поведение клеток и формирование сети.
Основные результаты
- Эндотелиальные сети формировались более обширно в присутствии FGF-2 по сравнению с BMP-2.
- Более высокая взаимосвязанность наблюдалась при добавлении факторов роста, чем без них.
- Количественный анализ выявил значительные различия в длине сетей и количестве соединений в зависимости от наличия факторов роста.
- Модель успешно продемонстрировала возможность создания определенных сосудистых ниш.
Выводы
- Разработанная модель является ценным инструментом для изучения сосудистых ниш костного мозга.
- Последовательный посев клеток повышает сложность исследований in vitro.
- Факторы роста оказывают значительное влияние на развитие эндотелиальной сети.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Создание васкуляризированной остеогенной ниши костного мозга в высокопроизводительном формате, совместимом с методами визуализации, восполняет критический пробел в доклинической разработке лекарственных препаратов. Данная платформа на основе 3D-гидрогеля ПЭГ позволяет осуществлять контролируемый анализ клеточных и молекулярных взаимодействий, значимых для биологии костной ткани и костного мозга, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки препаратов для лечения онкологических и костных заболеваний. Воспроизводимость и возможность количественной оценки данной системы способствуют надежной валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов действия для продвижения портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точное манипулирование клеточными и матриксными компонентами для проверки гипотез при валидации мишеней.
- Поддерживает снижение механистических рисков путем изоляции эффектов факторов роста и типов клеток на формирование сосудистой ниши.
- Способствует функциональной оценке остеогенных и ангиогенных путей в соответствующем патологии 3D-контексте.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую систему 3D-сокультивирования, совместимую с высокопроизводительной визуализацией и количественным анализом.
- Позволяет проводить надежное количественное измерение параметров сосудистой сети и маркеров остеогенной дифференцировки.
- Обеспечивает масштабируемые, готовые к автоматизации рабочие процессы для скрининга соединений и фенотипического анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирует микроокружение костного мозга человека для трансляционных исследований взаимодействий раковых клеток и метастазирования.
- Соответствует биомаркерным подходам за счет количественного определения активности ALP и показателей сосудистой сети.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, связывая 2D-модели in vitro и модели in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта платформа интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез, количественный скрининг и трансляционное моделирование в рамках единой многоразовой системы.
- Поисковая биология: позволяет изолировать и тестировать определенные факторы роста или типы клеток для выяснения роли сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели сосудистых и остеогенных конечных точек, подходящие для высокопроизводительного анализа.
- Аналитика: поддерживает автоматизированный анализ изображений и нормализацию для надежного сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: предоставляют релевантную модель человека для изучения взаимодействий в нише «рак — костный мозг».
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульную, адаптируемую платформу для различных программ НИОКР, направленных на изучение костей, костного мозга или метастатических заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает биологическую неопределенность при валидации мишеней и сигнальных путей.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость для многоцентровых и кросс-функциональных групп.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет получения надежных количественных данных на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков и продвигать кандидатов с подтвержденными механистическими основами.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с трехмерным (3D) культивированием клеток, визуализацией и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии, планшетным ридерам и совместимому аналитическому программному обеспечению (например, ImageJ).
- Требуется межкомандная стандартизация источников клеток, приготовления матрикса и протоколов количественного анализа.
- Метод адаптируем для различных типов клеток и условий применения факторов роста для моделирования конкретных заболеваний.
- Ограничения включают необходимость тщательной нормализации и валидации алгоритмов количественного анализа между сериями экспериментов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Establishing the 3D Stromal Monoculture
2:44
Establishing the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
4:25
Quantifying the Endothelial Cell Network Formation after the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
6:53
Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal‐Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity
