Оптимизированное выделение ядер из свежих и замороженных образцов твердых опухолей для секвенирования мультиома
13 октября 2023 г.
Протокол обеспечивает надежный и оптимизированный подход к выделению ядер из солидных образцов опухолей для мультиомного секвенирования с использованием платформы 10x Genomics, включая рекомендации по условиям диссоциации тканей, криоконсервации одноклеточных суспензий и оценке изолированных ядер.
По мере того, как растут наши знания о биологии опухолей и интерес к пониманию тонкостей того, как клетки взаимодействуют внутри опухоли и влияют на результаты лечения пациентов, важность анализа гетерогенных клеток в микроокружении опухоли также возрастает. Мультиомное секвенирование, которое позволяет получать РНК одной клетки и секвенировать атаку из одной и той же клетки в парном клеточном режиме, обеспечивает значительный прогресс в достижении этой цели. Однако качество данных, полученных в ходе этих экспериментов, сильно зависит от качества условий эксперимента и вводимого биологического материала.
Этот протокол обеспечивает надежный и оптимизированный подход к выделению ядер из солидных образцов опухолей для мультиомного секвенирования с использованием платформы 10x Genomics. Этот протокол надежен при использовании как свежих, так и замороженных одноячеистых суспензий. Даны рекомендации по условиям диссоциации тканей, криоконсервации одноклеточных суспензий, оценке изолированных ядер.
В этом протоколе мы использовали образцы протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека, которые являются основным типом тканевого фокуса в нашей лаборатории. Рак поджелудочной железы представляет собой высокодесмопластический тип опухоли, который предвещает относительно липкую ткань, а также клетки. Кроме того, поскольку образцы опухолей поджелудочной железы, доступные для исследования, также имеют тенденцию быть относительно небольшими, предпринимаются усилия для максимального увеличения количества захваченных клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан надежный и оптимизированный метод выделения ядер из образцов солидных опухолей для мультиомиксного секвенирования с использованием платформы 10x Genomics. Он включает рекомендации по условиям диссоциации тканей и криоконсервации суспензий одиночных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Геномика
Обзор
- Понимание биологии опухолей имеет решающее значение для улучшения исходов лечения пациентов.
- Анализ гетерогенных клеток в микроокружении опухоли приобретает все большее значение.
- Мультиомное секвенирование позволяет проводить парное получение данных секвенирования RNA и ATAC на уровне отдельных клеток.
- Качество данных в значительной степени зависит от условий эксперимента и биологического материала.
Цель исследования
- Предоставить надежный протокол выделения ядер из солидных опухолей.
- Повысить качество данных мультиомного секвенирования.
- Облегчить анализ микроокружения опухоли.
Используемые методы
- Выделение ядер из образцов солидных опухолей.
- Использование свежих или замороженных суспензий единичных клеток.
- Рекомендации по условиям диссоциации тканей.
- Методы криоконсервации суспензий единичных клеток.
Основные результаты
- Был разработан оптимизированный подход к выделению ядер.
- Получены достоверные результаты как на свежих, так и на замороженных образцах.
- Повышено качество данных для мультиомного секвенирования.
- Представлены рекомендации по обработке тканей и криоконсервации.
Выводы
- Данный протокол повышает достоверность выделения ядер из опухолей.
- Он способствует развитию методов мультиомиксного секвенирования.
- Будущие исследования могут извлечь выгоду из улучшенных условий проведения экспериментов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оптимизированное выделение ядер из образцов солидных опухолей имеет решающее значение для получения высококачественных данных мультиомиксного секвенирования, что напрямую влияет на достоверность анализа гетерогенности опухолей в трансляционной онкологии. Данный протокол решает задачу извлечения интактных ядер как из свежих, так и из замороженных десмопластических опухолевых тканей, обеспечивая надежное одноклеточное мультиомиксное профилирование. Качественная подготовка ядер на этом этапе повышает точность прогнозирования в последующих этапах поиска и разработки биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает высокоточное исследование гетерогенности опухолевых клеток на уровне отдельных клеток.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения разнообразных популяций клеток в процессе изоляции.
- Способствует снижению механистических рисков благодаря точному воспроизведению микроокружения опухоли.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную подготовку ядер для воспроизводимого мультиомного секвенирования.
- Гарантирует количественную и качественную однородность исходного материала для последующих этапов анализа.
- Повышает готовность анализа за счет возможности использования как свежих, так и криоконсервированных образцов опухоли.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует задачам поиска трансляционных биомаркеров, обеспечивая сопряженное профилирование РНК и доступности хроматина.
- Сохраняет клиническую значимость за счет отражения сложности микроокружения солидных опухолей.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет стандартизации качества исходного материала.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол выделения ядер находится на стыке обработки тканей и генерации мультиомных данных, связывая этапы первичных открытий с рабочими процессами трансляционных исследований.
- Открывающая биология: Максимизирует мощность проверки гипотез за счет сохранения разнообразия и целостности клеток.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимое получение высококачественных ядер для масштабируемых анализов мультиомного секвенирования.
- Аналитика: Позволяет получать надежные количественные показатели для сравнения состояний опухолевых клеток и ландшафтов хроматина.
- Трансляционные исследования: Облегчает согласование биомаркеров за счет поддержки парного анализа одноядерного RNA-seq и ATAC-seq.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный, адаптируемый протокол для различных типов солидных опухолей и условий подготовки образцов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов в исследованиях биологии опухолей и валидации мишеней.
- Практическая ценность: улучшает воспроизводимость и масштабируемость при работе со свежими и замороженными образцами опухолей.
- Стратегическая ценность: снижает риск потери данных или появления артефактов на этапе подготовки образцов.
- Влияние на портфель: способствует более точному с учетом рисков продвижению программ по поиску новых лекарств в онкологии и трансляционным исследованийм.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссоциации тканей и работы с ядрами для достижения оптимального выхода и качества.
- Необходим доступ к специализированным реагентам, фильтрам для клеток и инструментам количественной оценки.
- Требуется межгрупповая стандартизация условий переваривания и лизиса для обеспечения воспроизводимости.
- Метод должен быть адаптирован под различные типы опухолей и размеры образцов, особенно для десмопластических тканей.
- Тщательный мониторинг целостности ядер необходим для предотвращения появления артефактов при последующем секвенировании.
