Гибридизация Цепная реакция РНК Флуоресценция in situ Гибридизация хемосенсорных генов в обонятельных придатках комаров
17 ноября 2023 г.
В статье описаны методы и реагенты, необходимые для проведения гибридизации цепной реакции РНК флуоресценции in situ (HCR RNA WM-FISH) для получения информации о пространственном и клеточном разрешении генов хемосенсорных рецепторов в антенне комара и верхнечелюстных пальпах.
Наша группа интересуется хемосенсорной системой комаров. Мы надеемся, что, воздействуя на чувство вкуса и обоняния комара, мы сможем помешать ему найти нас и укусить. Гибридизация цепной реакции, флуоресцентная гибридизация in situ, является недавней разработкой.
Эта технология очень чувствительна, надежна и способна мультиплексировать несколько генов-мишеней таким образом, что мы можем визуализировать экспрессию и локализацию этих генов одновременно в их родной среде. Специальная транскриптомика является передовым методом, используемым в области пространственной биологии. Эта технология способна мультиплексировать несколько тысяч генов, и вы можете визуализировать экспрессию этих генов одновременно.
Наш протокол позволяет нам напрямую визуализировать, какие нейроны в антенне экспрессируют любой из 50 или около того возможных ионотропных рецепторов. Это дает нам фундаментальную дорожную карту, которая направляет наше понимание того, как рецепторы этого классического фактора могут опосредуть поведение. Обонятельные нейроны в обонятельных органах насекомого, таких как антенна, обычно скрыты внутри защитной хитиновой оболочки.
Это делает визуализацию экспрессии обонятельных рецепторов в этих нейронах очень сложной. Наш протокол использует комбинацию лечения хитиназой и современных флуоресцентных и прозрачных протоколов для преодоления этих проблем.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол флуоресцентной гибридизации in situ целого объекта с использованием цепной реакции гибридизации РНК (HCR RNA WM-FISH), предназначенный для выявления пространственной и клеточной экспрессии генов хемосенсорных рецепторов в антеннах и верхнечелюстных щупальцах комаров. Благодаря использованию передовых методов флуоресценции, исследование проливает свет на хемосенсорные системы и их потенциальное влияние на поведение комаров и их взаимодействие с окружающей средой.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биотехнология
- Энтомология
Теоретические сведения
- Хемосенсорная система комаров имеет решающее значение для их поведения.
- Методы гибридизационной цепной реакции позволяют проводить мультиплексную визуализацию экспрессии генов.
- Визуализация обонятельных рецепторов затруднена из-за анатомических особенностей.
- Обработка хитиназой помогает преодолеть барьеры при визуализации тканей.
Цель исследования
- Разработать метод одновременной визуализации нескольких генов хемосенсорных рецепторов.
- Получить данные о локализации и паттернах экспрессии этих рецепторов.
- Способствовать более глубокому пониманию сенсорного поведения комаров.
Используемые методы
- В протоколе используются методы WM-FISH РНК с реакцией гибридизации по цепям.
- В качестве биологической модели используются комары рода Anopheles.
- Специфические мультиомиксные рабочие процессы не упоминались.
- Основные этапы включают фиксацию тканей, обезвоживание и гибридизацию с точным соблюдением времени инкубации при различных температурах.
- Визуализация проводится путем получения изображений после заключения препаратов на предметные стекла.
Основные результаты
- Были выяснены паттерны экспрессии нескольких ионотропных рецепторов в антеннах комара.
- Были отмечены значительные различия в обилии рецепторов, при этом IR64a экспрессировался существенно сильнее.
- Колокализация различных семейств рецепторов указала на сложные взаимодействия внутри хемосенсорных тканей.
- Полученные результаты способствуют пониманию того, как эти рецепторы опосредуют сенсорное поведение.
Выводы
- Данное исследование позволяет глубже понять хемосенсорные системы комаров с помощью передовых методов визуализации.
- Разработанные методы могут способствовать дальнейшему изучению роли сенсорных рецепторов в поведении комаров.
- Полученные данные могут лечь в основу стратегий по контролю взаимодействий комаров с человеком.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Пространственное картирование экспрессии хемосенсорных генов в обонятельных придатках комаров позволяет проводить высокоразрешающую валидацию мишеней для стратегий борьбы с переносчиками. Протокол HCR RNA WM-FISH обеспечивает надежное мультиплексное детектирование экспрессии генов, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и снижает механистические риски. Эта возможность имеет непосредственное значение для биофармацевтических групп, стремящихся исследовать сенсорные пути и определить приоритетные молекулярные мишени у насекомых — переносчиков заболеваний.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить пространственно-разрешенный анализ экспрессии хемосенсорных генов в нативных тканях.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем картирования локализации рецепторов с одноклеточным разрешением.
- Способствует снижению механистических рисков за счет уточнения коэкспрессии рецепторов и архитектуры путей.
- Предоставляет базовые данные для приоритизации мишеней сенсорных путей в биологии переносчиков.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга модуляторов или ингибиторов.
- Получение количественных, воспроизводимых мультиплексных данных для стандартизации анализа.
- Обеспечение надежного детектирования нескольких генных мишеней в рамках одного рабочего процесса, что способствует масштабируемости.
- Повышение готовности к скринингу за счет подтверждения наличия мишеней и их пространственного распределения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет пространственную экспрессию генов с релевантным заболеванию сенсорным поведением у видов-переносчиков.
- Обеспечивает трансляционную преемственность, позволяя адаптировать метод для других моделей насекомых или тканей.
- Обладает прогностической ценностью для доклинических исследований, направленных на хемосенсорные пути.
- Способствует продвижению кандидатов для контроля переносчиков с учетом рисков на основе молекулярных доказательств.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в цикл научных исследований: от ранней валидации мишеней до разработки анализа и трансляционных исследований в области биологии переносчиков.
- Открывающая биология: Поддержка проверки гипотез и уточнения сигнальных путей посредством картирования экспрессии генов in situ.
- Скрининг: Подтверждение готовности и воспроизводимости анализа с помощью мультиплексных количественных данных.
- Аналитика: Предоставление пространственных и количественных измерений для сравнения экспрессии генов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Возможность адаптации к другим моделям насекомых, обеспечивающая преемственность программ, направленных на борьбу с переносчиками.
- Корпоративное повторное использование: Создание многоразовой платформы для пространственной транскриптомики в различных биологических системах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при выборе мишеней.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы анализа пространственной экспрессии генов.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в НИОКР по поиску вектороспецифических мишеней.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней сенсорных путей для контроля переносчиков с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции тканей, пространственной транскриптомики и флуоресцентной визуализации.
- Необходим доступ к гибридизационным печам, флуоресцентным микроскопам и аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация дизайна зондов и протоколов визуализации.
- Адаптация к другим моделям насекомых может потребовать оптимизации протокола в зависимости от типа и размера ткани.
- Точность при работе с тканями имеет критическое значение из-за хрупкости органов обоняния.
