Ex Vivo Культивирование циркулирующих опухолевых клеток в спинномозговой жидкости у пациентов с меланомой для изучения меланома-ассоциированной лептоменингеальной болезни
29 марта 2024 г.
В данной статье описан протокол распространения циркулирующих в спинномозговой жидкости опухолевых клеток (ЦОК) спинномозговой жидкости, собранных у пациентов с меланомально-ассоциированной лептоменингеальной болезнью (М-ЛМД) для разработки доклинических моделей для изучения М-ЛМД.
Лептоменингеальная болезнь, вызванная меланомой или МЛМД, представляет собой агрессивную форму метастазирования мозговых оболочек, при которой циркулирующие опухолевые клетки или ЦОК проникают в спинномозговую жидкость. К сожалению, не существует эффективных методов лечения МЛМД, поэтому понимание его биологии поможет разработать методы лечения для снижения смертности. Недавние исследования показали, как ЦОК могут колонизировать питательные рубцы в среде спинномозговой жидкости, например, используя способность поглощать железо для повышения своей выживаемости и комплементара C3 для содействия инвазии в спинномозговую жидкость через сосудистое сплетение.
Таким образом, ЦОК являются очень хорошими инструментами для изучения МЛМД. Самой большой проблемой в изучении ЦОК в спинномозговой жидкости является общее отсутствие доклинической модели и дефицит этих клеток. Поиск способов выращивания этих редких и хрупких клеток у пациентов и создание модели ксенотрансплантата принесет большую пользу исследователям в понимании патологии MLMD и разработке рациональных методов лечения.
Мы разработали метод, который успешно размножил ЦОК в спинномозговой жидкости от пациентов с MLMD in vitro и in-vivo, что дало нам возможность проводить молекулярный и функциональный анализ клеток MLMD, а также исследование эффективности в моделях ксенотрансплантатов. Несмотря на то, что существующие методологии несовершенны, но возможность культивировать и расширять ЦОК СМЖ у пациентов с меланомой впервые дала нам понимание важности понимания микроокружения СМЖ.
Обзор
В данной статье описывается протокол размножения опухолевых клеток, циркулирующих в спинномозговой жидкости (CSF-CTCs), выделенных у пациентов с лептоменингеальным метастазированием при меланоме (M-LMD), для создания доклинических моделей по изучению M-LMD.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Лептоменингеальный метастаз меланомы (M-LMD) представляет собой тяжелую форму метастазирования.
- Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) проникают в цереброспинальную жидкость, что осложняет выбор вариантов лечения.
- Понимание биологии ЦОК имеет решающее значение для разработки эффективных методов терапии.
- Современные методологии изучения ЦОК в цереброспинальной жидкости ограничены.
Цель исследования
- Для размножения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) спинномозговой жидкости пациентов с M-LMD.
- Для создания доклинических моделей для изучения патологии M-LMD.
- Для проведения молекулярного и функционального анализа клеток при M-LMD.
Используемые методы
- Предварительная обработка флаконов T175 поли-L-лизином для культивирования клеток.
- Использование клеток мозговых оболочек человека для приготовления кондиционированной среды.
- Центрифугирование и обработка образцов спинномозговой жидкости.
- Создание моделей ксенотрансплантатов у иммунодефицитных мышей.
Основные результаты
- Успешное размножение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) спинномозговой жидкости (СМЖ) in vitro и in vivo.
- Получение новых данных о роли микроокружения СМЖ в выживании ЦОК.
- Идентификация факторов роста, улучшающих культивирование ЦОК.
- Разработка методологии для эффективного изучения лептоменингеального метастатического заболевания (ЛМЗ).
Выводы
- Культивирование циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) спинномозговой жидкости представляет собой ценный инструмент для исследования лептоменингеального метастазирования (LMD) при меланоме (M).
- Понимание биологии ЦОК может привести к разработке новых терапевтических стратегий.
- Для достижения оптимальных результатов необходима дальнейшая доработка методик.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание культур ex vivo циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), выделенных из спинномозговой жидкости (СМЖ) при меланоме с лептоменингеальным метастазированием (M-LMD), позволяет устранить критический пробел в доклинических онкологических исследованиях. Эта возможность обеспечивает механическое снижение рисков и валидацию мишеней для терапии, направленной на крайне летальную метастатическую нишу с ограниченным выбором методов лечения. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и обеспечивает трансляционную преемственность для развития портфеля препаратов в области нейроонкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы в микросреде СМЖ, релевантной для данного заболевания.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней, участвующих в выживании и колонизации CTC.
- Способствует снижению механистических рисков путем моделирования биологии M-LMD на клеточном уровне.
- Предоставляет платформу для тестирования специфических ингибиторов путей в клетках, полученных от пациентов.
Скрининг и разработка анализа
- Создает воспроизводимые системы ex vivo для количественной оценки эффективности препаратов.
- Стандартизирует условия культивирования с использованием сред, кондиционированных клетками HMC, для повышения достоверности анализа.
- Обеспечивает экспансию редких циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) для последующего молекулярного и функционального анализа.
- Подготавливает валидированные клеточные линии для масштабируемых рабочих процессов скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Создание моделей мышиных ксенотрансплантатов для доклинической оценки потенциальных методов терапии.
- Сопоставление результатов in vitro с прогрессированием заболевания и терапевтическим ответом in vivo.
- Обеспечение идентификации трансляционных биомаркеров, связанных с путями выживания CTC.
- Обеспечение обоснованного с учетом рисков продвижения новых ингибиторов, нацеленных на пути IGF и MAPK.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол связывает этапы первичного поиска и доклинической валидации, обеспечивая возможность размножения и функционального изучения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), выделенных из спинномозговой жидкости пациентов. Он интегрируется в рабочие процессы, охватывающие валидацию мишеней, разработку анализов и тестирование эффективности in vivo.
- Поисковая биология: Обеспечивает платформу для проверки гипотез и выяснения сигнальных путей в клинически значимом контексте.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для оценки соединений на циркулирующих опухолевых клетках (ЦОК), полученных от пациентов.
- Аналитика: Поддерживает молекулярное и цитокиновый профилирование для сравнения факторов выживаемости и ответов на препараты.
- Трансляционные исследования: Способствует обеспечению преемственности от культур ex vivo к моделированию in vivo и поиску биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимый рабочий процесс для изучения метастазирования, вызванного ЦОК, в рамках нейроонкологических портфелей исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов в исследованиях M-LMD.
- Операционная ценность: стандартизирует культивирование редких клеток и расширяет доступ к функциональным доклиническим моделям.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективно приоритизировать активы в области нейроонкологии с учетом затрат капитала.
- Влияние на портфель: способствует продвижению проектов с учетом рисков и обеспечивает обмен опытом между программами в исследованиях метастатических заболеваний.
Рекомендации по внедрению
- Требуются экспертные знания в области изоляции редких клеток и методов экс виво культивирования.
- Необходим доступ к специализированной инфраструктуре для культивирования клеток и подготовке кондиционированных сред.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация метода для других типов опухолей или популяций клеток, полученных из спинномозговой жидкости.
- Зависимость от наличия образцов спинномозговой жидкости, полученных от пациентов, и иммунодефицитных моделей животных.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
Preparation of Human Meningeal Cell (HMC) Conditioned Media and Collection of Cerebrospinal Fluid for the Culture of Circulating Tumor Cells
3:23
In Vitro Culture and Expansion of Cerebro Spinal Fluid (CSF)-Circulating Tumor Cells (CTCs) for the Study of Leptomeningeal Disease
4:24
CSF Collection from Mice with Leptomeningeal Disease for Subsequent Clone Expansion
