Выделение костного мозга мышей у новорожденных и получение макрофагов костного мозга
24 мая 2024 г.
Этот протокол описывает неферментативный и простой метод выделения 7-9-дневных клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов с использованием надосадочной жидкости клеток L929 в качестве источника гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Макрофаги, полученные из костного мозга, были дополнительно проанализированы на поверхностные антигены F4/80, CD206, CD11b и функциональную компетентность.
Цель данного исследования состоит в том, чтобы понять некоторые ограничения иммунного ответа на бактериальную инфекцию в раннем возрасте. Для этого нам необходимо разработать и использовать исследовательские модели, специфичные для новорожденных. Выделение костного мозга у семидневного щенка является сложной задачей и не очень хорошо установлено.
Макрофаги, полученные из костного мозга новорожденных, чувствительны и подвержены стрессу по сравнению с другими МПКТ. Методика, используемая в этом протоколе, проста и воспроизводима. Этот метод помогает пользователям изолировать костный мозг новорожденных мышей в возрасте от семи до девяти дней без использования каких-либо ферментов.
В этом исследовании представлена стандартизированная стратегия получения макрофагов, полученных из костного мозга у неонатальных мышей, которые могут быть использованы для решения вопросов неонатальной иммунологии. Этот воспроизводимый метод обеспечивает возрастную модель для продвижения исследований неонатальной иммунизации во многих областях знаний.
Обзор
В данном протоколе описывается неферментативный метод выделения клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов. Исследование сосредоточено на особенностях работы с новорожденными мышами в возрасте 7–9 дней и чувствительности полученных из костного мозга макрофагов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Понимание иммунного ответа на бактериальные инфекции на ранних этапах жизни.
- Трудности выделения костного мозга из новорожденных мышей.
- Макрофаги, полученные из костного мозга новорожденных, чувствительны и подвержены стрессу.
- Необходимость в воспроизводимых методах проведения исследований на новорожденных.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения костного мозга из новорожденных мышей.
- Получить функциональные макрофаги для исследований иммунного ответа.
- Углубить понимание иммунных реакций у новорожденных.
Используемые методы
- Выделение костного мозга из новорожденных мышей в возрасте 7–9 дней.
- Неферментативный метод выделения клеток.
- Использование супернатанта клеток L929 в качестве источника M-CSF.
- Анализ поверхностных антигенов и функциональной полноценности макрофагов.
Основные результаты
- Успешное выделение макрофагов из костного мозга новорожденных.
- Характеристика макрофагов с использованием поверхностных антигенов F4/80, CD206 и CD11b.
- Демонстрация функциональной компетенции полученных макрофагов.
- Подтверждение простоты и воспроизводимости данного метода.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения иммунного ответа новорожденных.
- Изолированные макрофаги могут быть использованы для дальнейших иммунологических исследований.
- Эта методика может способствовать прогрессу в исследованиях здоровья новорожденных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежное выделение и дифференцировка макрофагов, полученных из костного мозга новорожденных мышей, устраняет критический пробел в моделировании иммунных ответов в раннем возрасте для иммунологических исследований на этапе поиска новых терапевтических мишеней. Данный стандартизированный протокол, не требующий применения ферментов, позволяет проводить механизмистические исследования с учетом возрастных особенностей, что повышает прогностическую достоверность моделей заболеваний новорожденных и трансляционных исследований. Этот метод повышает значимость портфеля исследований, позволяя проводить функциональные анализы иммунных клеток, адаптированные к биологии новорожденных.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать иммунные механизмы новорожденных, которые отличаются от систем взрослых организмов.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней в моделях воспаления и инфекции, специфичных для данного возраста.
- Способствует снижению биологических рисков при проверке гипотез в области иммунологии новорожденных.
- Повышает прогностическую достоверность в отношении терапевтических мишеней для раннего периода жизни.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую подготовку макрофагов новорожденных для последующих анализов.
- Позволяет проводить количественную оценку фагоцитарной функции с использованием бактерий, конъюгированных с pH-чувствительным красителем.
- Поддерживает проведение проточного цитометрического анализа поверхностных маркеров для валидации анализа.
- Позволяет подготовить валидированные клеточные системы для скрининга соединений в контексте новорожденных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели макрофагов in vitro в соответствие с иммунными ответами новорожденных, имеющими значение для заболевания.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации на возрастных моделях.
- Поддерживает продвижение программ по иммунологии новорожденных с учетом скорректированных рисков.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков для исследований инфекций и воспалений в раннем возрасте.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в континуум от поиска мишеней до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез, функциональной валидации и количественного анализа в моделях иммунитета новорожденных.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает возможность проведения механистических исследований функций иммунных клеток новорожденных и анализа сигнальных путей.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые, готовые к анализу макрофаги для функционального и фенотипического скрининга.
- Аналитика: Обеспечивает получение количественных данных с помощью проточной цитометрии и анализов фагоцитоза для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает этап фундаментальных открытий с доклиническими работами с использованием моделей иммунных клеток, соответствующих возрасту.
- Корпоративное использование: Устанавливает повторно используемый стандартизированный рабочий процесс подготовки иммунных клеток новорожденных для различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях иммунной системы новорожденных.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую и масштабируемую подготовку клеток для сопоставимости результатов различных исследований.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о целесообразности продолжения разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в портфелях исследований по иммунологии новорожденных.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению мишеней иммунной системы раннего периода жизни.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с новорожденными мышами и владение методами стерильной техники.
- Необходим доступ к проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для функционального и фенотипического анализа.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости в многоцентровых исследованиях.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных линий мышей или возрастных интервалов.
- Выход клеток и чувствительность к стрессу могут ограничивать масштабируемость по сравнению с моделями на взрослых животных.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Non‐Enzymatic Method for Isolating Neonatal Mouse Bone Marrow Cells
2:42
Differentiation of Neonatal Bone Marrow‐Derived Macrophages Using a Supernatant of L929 Cells
4:37
Assessing Phagocytic Function of Neonatal Bone Marrow‐Derived Macrophages Using a Fluorescent Bacterial Uptake Assay
