Создание и анализ гистологических изображений с высокими параметрами с помощью гистопрофлоуцитометрии
21 июня 2024 г.
Здесь описан метод, который может быть использован для визуализации пяти или более флуоресцентных параметров с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Описан конвейер анализа для извлечения отдельных клеток из этих изображений и проведения анализа отдельных клеток с помощью стратегий проточной цитометрии, подобных гейтингу, которые могут идентифицировать подмножества клеток в срезах тканей.
Наша главная цель состоит в том, чтобы изучить, как клетки иммунной системы и глиальные клетки центральной нервной системы способствуют развитию и прогрессированию неврологических расстройств, таких как рассеянный склероз. Иммунофлуоресцентная микроскопия является стандартным и широко используемым методом в биологических дисциплинах и имеет важное значение для исследований в области неврологии и иммунологии. Одна из основных проблем, с которой сталкиваются исследователи, заключается в том, что иммунофлуоресцентная микроскопия, как правило, ограничена в количестве зондов, которые могут быть визуализированы за один раз, из-за ограничений обычных микроскопов.
В этом протоколе мы описываем метод, позволяющий увеличить количество зондов, которые многие микроскопы могут визуализировать одновременно, и предоставить конвейер анализа для обработки изображений, насыщенных информацией. Преимущество этого протокола заключается в том, что он может быть адаптирован ко многим широко доступным микроскопам и прост в исполнении, что делает мультиплексный гистологический анализ доступным для большего числа лабораторий.
Обзор
В данном исследовании описывается метод визуализации нескольких флуоресцентных параметров с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, а также алгоритм анализа данных на уровне отдельных клеток. Этот метод расширяет возможности традиционной визуализации, позволяя идентифицировать подмножества клеток, связанных с функциями иммунных и глиальных клеток при неврологических расстройствах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Иммунофлуоресцентная микроскопия является основным методом в нейробиологии и иммунологии.
- В традиционных микроскопах существуют ограничения относительно количества зондов, которые можно визуализировать одновременно.
- Предлагаемый метод направлен на преодоление этих ограничений и повышение доступности мультиплексного гистологического анализа.
Цель исследования
- Разработать протокол, позволяющий осуществлять визуализацию и анализ нескольких флуоресцентных меток.
- Создать аналитический конвейер, поддерживающий анализ на уровне отдельных клеток, аналогичный проточной цитометрии.
- Обеспечить более глубокое понимание роли иммунных и глиальных клеток при неврологических расстройствах.
Используемые методы
- Для исследования окрашенных срезов тканей использовали иммунофлуоресцентную микроскопию.
- В исследовании подробно описан пошаговый подход к настройке микроскопа и проведению компенсации флуоресценции.
- Анализ изображений включал использование программных инструментов для разделения и маркировки отдельных клеток.
- Данный протокол допускает адаптацию под различные широко используемые микроскопы.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно дифференцировать различные типы клеток в окрашенной ткани лимфоидных органов.
- Для успешного разделения плотно расположенных клеток использовалось машинное обучение.
- Проведенный анализ позволил получить значимые данные о популяциях клеток в срезах тканей.
Выводы
- Данный протокол расширяет возможности традиционной иммунофлуоресцентной микроскопии.
- Разработанный алгоритм оптимизирует анализ на уровне отдельных клеток, обеспечивая более широкий доступ к мультиплексной гистологии.
- Полученные результаты могут углубить наше понимание клеточных механизмов, участвующих в развитии неврологических расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Многопараметрическая гистологическая визуализация с помощью гистофлюометрии устраняет критический разрыв в профилировании иммунных клеток, обеспечивая мультиплексный пространственный анализ с одноклеточным разрешением. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении механистических рисков, особенно для таких сложных тканей, как ЦНС. Данный подход способствует принятию решений по формированию портфеля препаратов за счет интеграции пространственного контекста с количественным анализом субпопуляций иммунных клеток, что дает важную информацию для ранних этапов поиска и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать разнообразие иммунных и глиальных клеток в пределах сохранной архитектуры ткани.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем картирования подмножеств клеток и их пространственных взаимодействий.
- Способствует снижению механистических рисков за счет высококонтентного мультиплексного анализа маркеров.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней в нейроиммунологических исследованиях.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные, информативные тканевые системы для последующего скринингового анализа.
- Стандартизирует количественные данные на уровне отдельных клеток с использованием стратегий гейтирования, аналогичных методам проточной цитометрии.
- Обеспечивает воспроизводимое профилирование популяций клеток при различных экспериментальных условиях.
- Поддерживает масштабируемую разработку анализов благодаря адаптации к широко доступным микроскопическим платформам.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие картирования подмножеств иммунных клеток моделям тканей ЦНС, имеющим значение для заболевания.
- Поддерживает пространственную и фенотипическую непрерывность на всех этапах — от первичного обнаружения до доклинической валидации.
- Позволяет осуществлять движение вперед с учетом рисков путем количественной оценки содержания типов клеток и тканевых взаимодействий.
- Предоставляет трансляционные данные о биомаркерах для исследований неврологических расстройств.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод связывает этапы ранних открытий и трансляционных исследований, объединяя многопараметрическую визуализацию с анализом единичных клеток, что позволяет оптимизировать рабочие процессы от проверки гипотез до валидации доклинических моделей.
- Биология открытий: Совершенствует проверку гипотез, обеспечивая мультиплексное пространственное и фенотипическое профилирование клеток.
- Скрининг: Предоставляет количественные, воспроизводимые данные на уровне отдельных клеток для надежной разработки анализов.
- Аналитика: Обеспечивает гейтирование по принципу проточной цитометрии и статистические результаты для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о подмножествах иммунных клеток со средами тканей, имеющими значение для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает широко адаптируемый конвейер визуализации и анализа для различных тканевых систем.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неопределенность механизмов в исследованиях иммунных клеток.
- Операционная ценность: стандартизирует мультиплексную визуализацию и анализ на различных платформах и в разных исследовательских группах.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно управлять портфелем проектов с точки зрения затрат капитала.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации программ по ЦНС и иммунологии с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с иммунофлуоресцентной микроскопией и спектральным разделением сигналов.
- Необходим доступ к совместимым микроскопам и современному программному обеспечению для анализа изображений.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов окрашивания, визуализации и гейтирования.
- Метод применим к различным типам тканей, но может потребовать оптимизации для конкретных моделей.
- Сложность анализа изображений и уровень владения программным обеспечением являются важными практическими аспектами.
