Оценка высвобождения LC3-II через внеклеточные везикулы в связи с накоплением внутриклеточных LC3-положительных везикул
18 октября 2024 г.
В данной статье мы представляем методологию краткой оценки уровня аутофагосомного маркера LC3-II во внеклеточных везикулах (ВВ) методом иммуноблоттинга. Анализ уровней LC3-II в ВВ, образовании аутолизосом и образовании омегасом позволяет предположить новую роль STX6 в высвобождении LC3-II-положительных ВВ при ингибировании слияния аутофагосом и лизосом.
Наши исследования сосредоточены на прогрессирующих нейродегенеративных заболеваниях, характеризующихся накоплением ядерного белка TDP-43 в цитоплазме, таких как БАС или FTLD-TDP. Мы стремимся понять, как патологии TDP-43 распространяются по мозгу прионоподобным образом. Ранее мы обнаружили, что высвобождение TDP-43 через внеклеточные везикулы опосредовано нарушением регуляции аутофагии.
Програнулин FTLD-TDP облегчает этот процесс. Следующая задача состоит в том, чтобы выяснить, как аутофагия регулирует производство и высвобождение внеклеточных везикул, содержащих TDP-43, что может привести к открытию терапевтических мишеней для БАС или FTLD-TDP. Для начала возьмите культивируемые клетки HeLa, подсчитайте их с помощью клеточного счетчика и засейте один умножить на десять в степени шести клеток на шестисантиметровой пластине, содержащей питательную среду.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и контролируемой влажностью в течение 24 часов. Далее приготовьте 20-микролярный раствор миРНК. Смешайте 100 микролитров восстановленной сывороточной среды и три микролитра миРНК в пробирке с низким удерживающим веществом для приготовления раствора А. Затем смешайте 100 микролитров восстановленной сывороточной среды и пять микролитров реагента для трансфекции в пробирке с низким удерживающим веществом для приготовления раствора В. После этого смешайте раствор А и раствор В, затем инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут.
Теперь добавьте смесь растворов А и В в среду, используемую для культивирования клеток HeLa, и инкубируйте в течение 24 часов. На следующий день промойте клетки PBS и подвергните клетки воздействию 500 микролитров 0,25% трипсина и одного миллимолярного раствора ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и контролируемой влажностью в течение пяти минут. Далее добавьте в клетки 2,5 миллилитров питательной среды и с помощью переводной пипетки Пастера с прикрепленным наконечником пипетки объемом 20 микролитров приготовьте одноклеточную суспензию.
После подсчета ячеек сеять один умножить на десять в степени шести клеток на десятисантиметровую пластину и инкубировать, как было продемонстрировано ранее. В конце инкубации готовят питательную среду, содержащую либо носитель, либо 100 наномолярного бафиломицина А1. Затем подвергают клетки воздействию среды, содержащей либо носитель, либо 100 наномолярный бафиломицин А1, и инкубируют в течение 24 часов. На следующий день соберите всю питательную среду с 10-сантиметровой пластины.
Переложите собранную среду в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте ее при 3000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Чтобы выделить фракцию внеклеточного везикулы Р1, перенесите надосадочную жидкость после центрифугирования при 3000 G в центрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при температуре 20 000 G при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.
Для выделения фракции внеклеточных везикул P2 перенесите надосадочную жидкость после центрифугирования при 20 000 G в ультрацентрифужную пробирку. Центрифугируйте его при 110 000 G при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. После вытирания лишней влаги внутри пробирки лабораторной салфеткой ресуспендируйте оставшиеся гранулы в центрифужной пробирке в 50 микролитрах двукратного буфера для проб для приготовления фракции внеклеточных везикул Р1.
Затем удалите надосадочную жидкость путем декантации. Сотрите лишнюю влагу внутри пробирки с помощью лабораторной салфетки и повторно суспендируйте оставшиеся гранулы в ультрацентрифугирующей пробирке в 50 микролитрах двукратного буфера для проб для приготовления фракции внеклеточных везикул Р2. Инкубируйте фракции внеклеточных везикул P1 и P2 при температуре 100 градусов Цельсия на тепловом блоке в течение 10 минут.
Переложив питательную среду из 10-сантиметровой тарелки в 15-миллилитровую пробирку, промойте клетки в 10-сантиметровой посуде PBS. Затем подвергните клетки воздействию двух миллилитров 0,25% трипсина и одного миллимолярного раствора ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и контролируемой влажностью в течение пяти минут. Добавьте в клетки восемь миллилитров питательной среды.
С помощью переводной пипетки Пастера с прикрепленным наконечником для пипетки объемом 200 микролитров нанесите пипетку на клетки, чтобы получить одноклеточную суспензию. Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте ее при 1000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора.
Добавьте PBS в клеточную таблетку и центрифугируйте при 1000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления PBS обработайте клеточную гранулу ультразвуком в одном миллилитре буфера A68, содержащего 1% саркозила. Смешайте 300 микролитров клеточного лизата со 100 микролитрами четырехкратного буфера для пробы.
Инкубируйте смесь при температуре 100 градусов Цельсия на термоблоке в течение 10 минут для приготовления клеточной фракции.
Обзор
В данном исследовании изучается роль белка TDP-43 в нейродегенеративных заболеваниях и его высвобождение посредством внеклеточных везикул (EV). В работе подчеркивается участие аутофагии в регуляции высвобождения TDP-43, что может помочь в поиске терапевтических мишеней для лечения БАС и ЛВД-TDP.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Нейродегенеративные заболевания
Теоретическая часть
- TDP-43 — это ядерный белок, связанный с нейродегенеративными заболеваниями.
- БАС и ЛВД-TDP характеризуются накоплением TDP-43 в цитоплазме.
- Понимание патологии TDP-43 может раскрыть механизмы распространения заболевания.
- Внеклеточные везикулы играют роль в высвобождении TDP-43.
Цель исследования
- Выяснить, как аутофагия регулирует выработку и высвобождение внеклеточных везикул, содержащих TDP-43.
- Изучить потенциальные терапевтические мишени для БАС и FTLD-TDP.
- Исследовать роль програнулина в высвобождении TDP-43.
Используемые методы
- Культивирование клеток HeLa.
- Подсчет клеток с помощью счетчика клеток.
- Посев клеток в культурную среду для проведения эксперимента.
- Иммуноблоттинг для оценки уровней маркеров автофагосом.
Основные результаты
- Определение роли STX6 в высвобождении LC3-II-положительных внеклеточных везикул (EV).
- Анализ эффектов ингибирования слияния автофагосом с лизосомами.
- Доказательства нарушения регуляции аутофагии при высвобождении TDP-43.
- Способствование высвобождению TDP-43 через EV посредством програнулина.
Выводы
- Аутофагия имеет решающее значение для регуляции высвобождения TDP-43.
- Воздействие на аутофагию может открыть новые терапевтические возможности при БАС и ФТЛД-TDP.
- Необходимы дальнейшие исследования для полного понимания задействованных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость для руководства
Количественная оценка высвобождения LC3-II через внеклеточные везикулы (ВКВ) открывает возможности для изучения механизмов аутофагия-зависимого транспорта белков — процесса, участвующего в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний. Данный протокол позволяет биофармацевтическим группам исследовать молекулярные детерминанты патологического распространения белков, что способствует валидации мишеней и обоснованному продвижению портфелей препаратов для лечения нейродегенерации. Этот подход повышает точность прогнозирования на стыке модуляции аутофагии и биомаркерного высвобождения, опосредованного ВКВ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет провести функциональную оценку генов, связанных с аутофагией, при ЭВ-опосредованном экспорте белков.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков путем изоляции влияния потенциальных мишеней, таких как STX6, на транспорт LC3-II.
- Способствует исследованию путей, значимых при заболеваниях, на основе гипотез в области нейродегенерации.
Скрининг и разработка методов анализа
- Представляет воспроизводимый рабочий процесс на основе иммуноблоттинга для количественного определения LC3-II в клеточных фракциях и фракциях внеклеточных везикул (EV).
- Устанавливает контроли анализа с использованием бафиломицина A1 для оценки степени ингибирования слияния автофагосом с лизосомами.
- Обеспечивает стандартизацию изоляции EV и количественного определения маркеров для последующего использования в скрининговых исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров за счет количественного определения LC3-II, ассоциированного с внеклеточными везикулами, при патологических изменениях.
- Обеспечивает преемственность от изучения механизмов до доклинической валидации вмешательств, модулирующих аутофагию.
- Предоставляет платформу для оценки внеклеточного распространения патологических белков в моделях нейродегенеративных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в цикл исследований от этапа открытия до доклинических испытаний, обеспечивая количественный механистический анализ аутофагии и биологии внеклеточных везикул (EV).
- Фундаментальная биология: позволяет проверить нулевую гипотезу для целевых генов, регулирующих экспорт LC3-II через внеклеточные везикулы (EV).
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные результаты иммуноблоттинга для сравнительного анализа различных условий.
- Аналитика: позволяет измерять уровни LC3-II и TSG101 в качестве ортогональных маркеров специфичности путей и везикул.
- Трансляционные исследования: связывает механистические данные с клинически значимыми моделями агрегации и распространения белков.
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульный рабочий процесс, адаптируемый к различным исследовательским программам по изучению аутофагии и EV.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней для путей аутофагии и EV.
- Операционная ценность: стандартизирует выделение EV и количественное определение LC3-II для проведения воспроизводимых и масштабируемых исследований.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки мишеней при нейродегенерации путем уточнения механистической роли в распространении белков.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов, модулирующих аутофагию, в пайплайнах препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, трансфекцией siRNA и методами иммуноблоттинга.
- Необходим доступ к оборудованию для высокоскоростного и ультрацентрифугирования для выделения EV.
- Требуется строгая стандартизация подготовки образцов и количественного определения маркеров между всеми группами исследователей.
- Метод применим к различным клеточным моделям, но может потребовать оптимизации для первичных культур или систем, релевантных конкретным заболеваниям.
- При интерпретации данных по LC3-II и TSG101 необходимо учитывать специфичность путей и экспериментальный контроль.
