Простая техника микроаспирации для выделения соматических клеток из криоконсервированной спермы лошадей в качестве ядерных доноров для клонирования
19 декабря 2025 г.
Этот протокол представляет простую технику микроаспирации для выделения жизнеспособных соматических клеток (СК) из криоконсервированной спермы лошадей. В отличие от традиционных методов, этот метод избегает длительных культур in vitro и помогает избежать загрязнения сперматозоидами, что позволяет немедленно применять их в клонировании соматических клеток.
Мы стремимся показать, что соматические клетки из криоконсервированной спермы лошадей могут быть полезны для восстановления особей с высокой генетической ценностью. Наша текущая задача — отобрать соматические клетки с целостной диплоидной ДНК для использования в качестве ядерного донора. Для начала достаньте конские соломинки спермы из резервуара с жидким азотом.
Подвергайте их воздействию воздуха на 10 секунд, а затем разморозите в водяной бане при 37 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Возьмите образец размороженной спермы объёмом 250 микролитров. Разбавьте его одним миллилитром дополнительного DMEM-F12 среднего вещества.
Инкубировать семянную смесь при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Пипетить 25 микролитров из инкубированного разбавления в трубку и разбавить его в 975 микролитрах DPBS с добавлением 0,1 миллиграмма на миллилитр поливинил-спирта или поливинилпиролидона. Аккуратно перемешайте подвеску.
Поддерживайте разбавленную семянную смесь при 37 градусах Цельсия на протяжении всего процесса сбора клеток. Поставьте крышку чашки Петри с разбавленной спермой лошадей на стадию микроскопа для подготовки к сбору соматических клеток. Выберите микропипетку подходящего диаметра для сбора соматических клеток и подключите её к системе механической аспирации.
Аккуратно вставьте микропипетку в микрокапель и выровняйте её с основанием крышки посуды. После того как пипетка аспирирует культурную среду, начинайте индивидуальный захват соматических клеток. Сосредоточьтесь на нижней части микродропа, где видны различные морфологии клеток.
Разместите кончик микропипетки рядом с каждой соматической ячейкой и аспирируйте под отрицательным давлением. Собирайте круглые и вытянутые клетки, независимо от размера. После сбора 10 клеток положите их в микрокаплю объемом 10 микролитров, расположенную на верхней поверхности крышки посуды.
Сохраняйте все собранные соматические клетки внутри этой микрокапли на протяжении всего процесса сбора. После сбора нужного количества соматических клеток выполните простую процедуру промывания с помощью микрокапель для удаления сперматозоидов, мусора и микробных загрязнителей. Используя вторую крышку посуды, выполните последовательную трёхступенчатую промывку соматических клеток.
Используйте микропипетку, чтобы перенести соматические клетки в первую каплю и дайте им осесть на три-пять минут. Перенесите клетки с первой капли во вторую, используя ту же процедуру. Повторите перенос ещё раз и поместите соматические клетки в третью каплю.
Наконец, изолированные соматические клетки поместите в подготовленную микрокаплю, предназначенную для переноса ядра соматических клеток. Метод микроаспирации успешно восстановил соматические клетки из криоконсервированной спермы лошадей, при этом скорость захвата составляла от 317,7 до 424,7 клеток в час у трёх жеребцов. Жеребец номер 3 показал самый высокий урожай.
По размеру и морфологии было выделено пять различных типов соматических клеток. Мы выявили популяцию соматических клеток, отличающихся морфологией и жизнеспособностью криоконсервированной спермы лошадей, что может быть полезно в качестве ядерного донора. Клетки можно отбирать на основе их морфологии, и процедура не требует установления первичной культуры.
Мы сосредоточимся на повышении жизнеспособности этих клеток после увеличения спермы лошадей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод микроаспирации для выделения жизнеспособных соматических клеток из криоконсервированного семени лошадей. Этот метод позволяет избежать длительного культивирования in vitro и контаминации сперматозоидами, что обеспечивает возможность немедленного использования клеток для клонирования соматическими клетками.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология репродукции
Теоретические основы
- Соматические клетки могут быть получены из криоконсервированного семени лошадей.
- Изоляция жизнеспособных соматических клеток имеет решающее значение для целей клонирования.
- Традиционные методы часто требуют длительного времени культивирования.
- Загрязнение сперматозоидами может затруднить процесс клонирования.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод выделения соматических клеток из семени лошадей.
- Обеспечить возможность использования этих клеток для клонирования особей с высокой генетической ценностью.
- Гарантировать, что выбранные соматические клетки имеют полноценную диплоидную ДНК.
Используемые методы
- Размораживание соломинок с семенем лошадей из жидкого азота.
- Использование водяной бани при температуре 37 °C для размораживания.
- Отбор проб и разведение размороженного семени в дополненной среде DMEM-F12.
- Применение метода микроаспирации для изоляции клеток.
Основные результаты
- Успешное выделение жизнеспособных соматических клеток.
- Снижение загрязнения сперматозоидами в процессе выделения.
- Возможность незамедлительного использования выделенных клеток для клонирования.
- Сохранение целостности диплоидной ДНК в отобранных клетках.
Выводы
- Метод микроаспирации эффективен для изоляции соматических клеток.
- Данный метод расширяет возможности клонирования соматических клеток у лошадей.
- Дальнейшее применение этого метода может привести к улучшению генетического восстановления в коневодстве.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективное выделение жизнеспособных соматических клеток из криоконсервированного семени лошадей устраняет критическое узкое место в использовании генетических ресурсов для передовых репродуктивных технологий. Данный метод микроаспирации обеспечивает немедленный доступ к диплоидным клеткам донора для переноса ядер соматических клеток (SCNT), исключая необходимость длительного культивирования и снижая риск контаминации сперматозоидами. Этот подход расширяет возможности генетического спасения и диверсификации портфеля в биотехнологических разработках в области животноводства.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую оценивать жизнеспособность соматических клеток и их диплоидный статус в криоконсервированных образцах.
- Обеспечивает функциональную проверку пригодности донорских ядер для процедур SCNT.
- Способствует снижению механистических рисков за счет возможности морфологического отбора донорских клеток.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает быстрый и воспроизводимый метод выделения соматических клеток без влияния сперматозоидов.
- Позволяет получать стандартизированные популяции клеток для последующих анализов по клонированию без необходимости создания первичной культуры.
- Обеспечивает количественную оценку выхода и морфологии клеток для оптимизации процесса.
Трансляционные и доклинические исследования
- Улучшает преемственность процесса от создания банков генетических ресурсов до применения методов преклинического клонирования.
- Соответствует трансляционным целям, обеспечивая возможность восстановления ценных генотипов из архивных материалов.
- Снижает биологический риск, гарантируя целостность донорских клеток перед генерацией эмбрионов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод микроаспирации объединяет этапы восстановления генетических ресурсов и клонирования на основе SCNT, связывая криоконсервационное хранение с непосредственной подготовкой ядерного донора.
- Открывающая биология: поддерживает проверку гипотез о жизнеспособности и генетической целостности донорских клеток из криоконсервированных источников.
- Скрининг: стандартизирует изоляцию соматических клеток для обеспечения воспроизводимости исходного материала при SCNT.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение выхода клеток и морфологического разнообразия.
- Трансляционные исследования: связывает биобанкированную сперму с практическими рабочими процессами клонирования для генетического спасения.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает универсальный протокол, применимый для образцов с различным генетическим фоном и архивных образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования пригодности донорских клеток и устраняет механистическую неопределенность при SCNT.
- Операционная ценность: оптимизирует изоляцию клеток, повышает воспроизводимость и исключает длительные этапы культивирования.
- Стратегическая ценность: позволяет быстро принимать решения о целесообразности («go/no-go») проектов по генетическому восстановлению и оптимизирует распределение ресурсов.
- Влияние на портфель: расширяет спектр жизнеспособного генетического материала для клонирования и стратегий селекции с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микроманипуляций и оценки морфологии клеток.
- Необходим доступ к системам механической аспирации и инфраструктуре микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация процедур отбора и промывки клеток.
- Метод применим к различным образцам семени, но может потребовать оптимизации для разных видов или условий консервации.
- Жизнеспособность клеток после изоляции может варьироваться, что необходимо контролировать для обеспечения готовности к SCNT.
