Тестирование физиологические барьеры на пути передачи вируса в Тли Использование Микроинъекция

Если насекомые являются эффективными переносчиками растительных вирусов, то при микроинъекции вируса процедура, которую мы продемонстрируем сегодня, представляет собой метод, позволяющий исследователям вводить вирус непосредственно в гемоциты AFib, минуя кишечник — один из двух основных барьеров при циркулятивной передаче вируса. Здравствуйте, я Сесилия Тамрин Дехи, постдок кафедры патологии растений Корнелльского университета. Сегодня я покажу вам, как вводить вирус в гемоциты AFib, после чего вирус может быть передан различным видам растений.

Например, это растение FE заражено вирусом скручивания листьев картофеля PLRV. Вы можете увидеть разницу между здоровым и зараженным растением. Наиболее заметным симптомом является склероз жилок.

PLRV представляет собой вирус, который переносится тлями в их гемолимфе — эквиваленте крови млекопитающих у насекомых. Когда неинфицированная тля питается зараженным растением, она заражается вирусом через сок растения, что можно увидеть здесь. После попадания в организм вирус должен переместиться из кишечника насекомого в гемолимфу, а затем пройти через слюнные железы, чтобы быть переданным обратно растению ESE.

И если при питании на растении ESE может быть захвачено множество вирусов, то лишь небольшая часть из них пройдет через кишечник и слюнные железы. Эти два основных барьера препятствуют передаче инфекции при заражении последующих тестовых растений. Если тля способна переносить вирус, мы скармливаем ее зараженной тканью в течение двух дней, после чего позволяем ей питаться на здоровом растении в течение пяти дней.

Затем растение подвергают фумигации, и через три недели мы начинаем поиск симптомов. Когда мы обнаруживаем AFib, который не может переносить вирус, мы можем определить, какой из двух барьеров препятствует вирусу, используя процедуру микроинъекции, которую я продемонстрирую сегодня. В ходе этой процедуры вирус вводится непосредственно в гемоцель, минуя барьер передачи через кишечник.

Итак, приступим; я покажу вам, как проводить микроинъекции в апекс. Перед вами стеклянные иглы, которые мы используем. Мы вытягиваем стеклянные иглы из этих стеклянных трубок с помощью микропуллера (apu).

Перед вами микроинъектор, предназначенный для микроинъекции вируса. Я приступаю к установке иглы в держатель.

Я просто вставляю иглу и фиксирую ее на месте. Теперь я ввожу вирус в иглу до верхней части этого шлема. Теперь нам нужно позиционировать AFI для микроинъекции.

Итак, я возьму тлю с помощью датчика давления и помещу ее в держатель для тли. В идеале я постараюсь расположить тлю спинкой к держателю, чтобы у меня был доступ к брюшной части насекомого. Хорошо, отлично.

Теперь можно приступить к микроинъекции. Теперь я positioned иголку и приближу ее к AFib. Далее я введу иголку в контакт с AFib; чтобы проколоть экзоскелет, лучше всего попытаться сделать прокол между сегментами у основания ног.

Теперь я приступаю к инъекции. Я беру AFI с помощью кисти и переношу его на восстанавливающую бумагу, где он останется на некоторое время. Нам также необходимо провести микроинъекцию контрольного AFI.

Данная контрольная микроинъекция проводится только с использованием буфера без вируса. Мы используем 0,1 М фосфатный буфер с pH 7. Я закреплю афид на здоровом растении, где он будет питаться в течение пяти дней; после этого я удалю афида и буду ждать развития симптомов. После микроинъекции одноцепочечной НК в течение недели ежедневно в афидах измеряется уровень экспрессии целевого гена.

Таким образом, мы только что провели микроинъекцию в AFI, который был неспособен передавать вирус. Если после микроинъекции AFI сможет передавать вирус, это будет означать, что у данного AFI имелся кишечный барьер, блокировавший вирус. Если же симптомы не разовьются, это будет означать, что у данного AFI сильный барьер в слюнных железах.

Таким образом, мы продемонстрировали способ микроинъекции вируса в тлей. Эта же процедура используется для микроинъекции двухцепочечной РНК в тлей для осуществления РНК-интерференции — интересного метода, помогающего изучать функции генов у тлей. На этом описание микроинъекции закончено.

Надеюсь, вам понравится этот материал и он окажется полезным для ваших экспериментов. Спасибо.