Количественная оценка цитотоксичности NK-клеток, усиленной химерными антигенными рецепторами и терапевтическими антителами с помощью живых клеток визуализации и потоковой цитометрии

Наша лаборатория изучает роль натуральных киллеров при нормальном состоянии организма и патологиях с целью использования их потенциала для совершенствования методов лечения солидных опухолей и рака крови. Существующим анализам цитотоксичности NK-клеток не хватает стандартизации между различными платформами и установками. Данный протокол предлагает воспроизводимые методы визуализации живых клеток и проточной цитометрии для точной оценки цитотоксичности.

Для начала приготовьте 10 миллилитров 2x SYTOX Orange, разводя стоковый раствор SYTOX Orange в культуральной среде для NK-92 в центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров с коническим дном. Подсчитайте количество целевых клеток с помощью счетчика Luna после смешивания с Trypan Blue или используйте любой валидированный метод подсчета клеток на основе исключения красителя. Перенесите необходимое количество целевых клеток в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров с коническим дном.

Центрифугируйте пробирку при 300G в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите супернатант. Затем повторно суспендируйте целевые клетки до конечной концентрации 250 000 клеток на миллилитр в среде 2X SYTOX Orange. Для подготовки эффекторных клеток оцените жизнеспособность и концентрацию клеток NK-92 и приступайте к работе только в том случае, если жизнеспособность превышает 80%, так как более низкая жизнеспособность может повлиять на результаты анализа.

Подсчитайте и перенесите необходимое количество клеток NK-92 в отдельные конические центрифужные пробирки объемом 15 мл. После центрифугирования ресуспендируйте клетки до конечной концентрации 500 000 клеток на мл. Приготовьте разведения эффекторных клеток, добавив 240 мкл суспензии эффекторных клеток в лунки 96-луночного планшета с круглым дном для обеспечения соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням 2:1, а в остальные лунки добавьте 120 мкл среды.

Выполните двукратные серийные разведения эффекторных клеток по отношению к клеткам-мишеням в соотношениях от 2:1 до 0,25:1, тщательно перемешивая содержимое путем пипетирования не менее пяти раз и меняя наконечники между переносами. Затем для организации совместного культивирования возьмите 96-луночный планшет с плоским дном, покрытый полилизином. Непосредственно перед переносом тщательно ресуспендируйте клетки-мишени и эффекторные клетки, избегая образования пузырьков, после чего добавьте по 100 µL каждой клеточной суспензии в соответствующие лунки.

Затем добавьте 200 µL PBS в соседние свободные лунки. Центрифугируйте планшет при 100G в течение двух минут при комнатной температуре. Поместите планшет в систему визуализации живых клеток.

Производите съемку изображений каждый час в течение 24 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. Проверьте качество изображений после первого сканирования и, при необходимости, скорректируйте настройки съемки. Настройте спектральное разделение, чтобы скомпенсировать перекрытие сигнала SYTOX Orange в зеленом канале.

Убедитесь, что оранжевые позитивные мертвые клетки не ошибочно идентифицируются как зеленые позитивные клетки. Для настройки поклеточного анализа неадгезивных клеток установите ожидаемый диаметр объекта на 15 µm, чтобы он соответствовал приблизительному диаметру клеток. Установите чувствительность порога и чувствительность текстуры на значение 5, а чувствительность края — на 10 для облегчения разделения клеточных кластеров.

Установите диапазон фильтрации площади принимаемых объектов от 50 до 2 000 квадратных микрометров, чтобы исключить клеточный детрит и крупные объекты. Установите максимальное значение эксцентриситета 0,95 для исключения неклеточных объектов. Используйте первичные NK-клетки человека, культивируемые в течение 16–24 часов.

Перенесите 500 000 целевых клеток в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Один раз промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Центрифугируйте клетки при 300G в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем удалите супернатант. Приготовьте 0,5 мкМ рабочий раствор карбоксифлуоресцеинового сукцинимидилового эфира (CFSE) в PBS, разбавив 1 мкл стокового раствора CFSE с концентрацией 5 мМ в 10 мл PBS. Ресуспендируйте полученный осадок в растворе CFSE с концентрацией примерно один миллион клеток на мл.

Инкубируйте клетки в течение 15 минут при 37 °C, обернув пробирки алюминиевой фольгой для защиты от света. Затем остановите реакцию, добавив от пяти до 10 объемов культуральной среды, и инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C. После центрифугирования клеток ресуспендируйте клеточный осадок до концентрации 250 000 клеток на мл, чтобы в 100 µL содержалось 25 000 клеток.

С помощью многоканального дозатора внесите в соответствующие лунки круглодонной 96-луночной планшета по 100 µL целевых клеток в каждую лунку. Каждый вариант опыта продублируйте в трех повторностях. Затем приготовьте по 200 µL 4X раствора антител в среде для культивирования NK-клеток для каждого исследуемого антитела и соответствующего изотипического контроля.

Перенесите растворы антител в планшет с глубокими лунками. Добавьте по 50 µL раствора антител в каждую лунку с целевыми клетками и тщательно перемешайте, выполнив пятикратное дозирование пипеткой. В лунки контрольного образца без антител добавьте по 50 µL среды для культивирования NK-клеток и тщательно перемешайте путем пипетирования.

Инкубируйте планшет в течение 25–30 минут при стандартных условиях инкубации. Проведите подсчет и отберите 200 000 NK-клеток; продолжайте работу только в том случае, если жизнеспособность составляет 75% или более. Ресуспендируйте клетки в 800 мкл среды для культивирования первичных NK-клеток человека до концентрации 250 000 клеток на миллилитр. Добавьте в соответствующие лунки по 50 мкл суспензии NK-клеток и тщательно перемешайте, прокачав содержимое пипеткой вверх-вниз не менее пяти раз.

Затем внесите по 50 µL культуральной среды в контрольные лунки и тщательно перемешайте. Внимательно осмотрите 96-луночный планшет с круглым дном, чтобы убедиться, что в каждой лунке находится 200 µL среды, уровни мениска равномерны и отсутствуют пузырьки воздуха. Центрифугируйте планшет в течение двух минут при 100G, затем инкубируйте его от 16 до 18 часов в стандартных условиях инкубации.

Центрифугируйте планшет в течение пяти минут при 300G и удалите супернатант. Промойте все лунки, добавив по 200 µL буфера для сортировки клеток с флуоресцентной активацией (FACS-буфера) в каждую лунку. Приготовьте мастер-микс поверхностных антител в FACS-буфере, как показано здесь.

Перевзвесьте клетки в 50 µL мастер-микса антител на лунку и тщательно перемешайте, прокачав суспензию пипеткой не менее пяти раз. Инкубируйте планшет в течение 15 минут при 4 °C, обернув его алюминиевой фольгой для защиты от света. Добавьте по 150 µL FACS-буфера в каждую лунку.

После центрифугирования суспендируйте клетки в 100 µL на лунку 5 µM DAPI в буфере для FACS. Немедленно переходите к сбору данных методом проточной цитометрии без предварительной инкубации. Выполните проточную цитометрию на приборе Cytek Aurora, регистрируя каналы флуоресценции для CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI и любых дополнительных флуорофоров.

В процессе совместного культивирования эффекторные клетки, живые и погибшие клетки-мишени визуализировали с помощью микроскопии живых клеток в режиме реального времени. Клетки CAR2-NK-92 и CAR3-NK-92 демонстрировали более быструю кинетику уничтожения по сравнению с клетками CAR1-NK-92, особенно на ранних временных точках при равном соотношении эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Эффективность уничтожения клеток-мишеней возрастала при увеличении соотношения эффекторных клеток к мишеням, включая контрольные клетки NK-92, которые проявили естественную цитотоксичность.

Клетки NK-92 CAR2 и CAR3 продемонстрировали более высокую эффективность при более низких соотношениях эффекторных клеток к клеткам-мишеням на более поздних временных точках. В то время как повышенная эффективность при промежуточных соотношениях эффекторных клеток к клеткам-мишеням наблюдалась на более ранних временных точках. Для количественной оценки эффективности клеток CAR-NK-92, кинетики киллинга и общего цитотоксического действия в популяциях эффекторов были определены три параметра: KR50, KT50 и IKI-50.

Добавление одного только даратумумаба не привело к снижению выживаемости мишеней, что подтверждает отсутствие прямого влияния антитела на жизнеспособность клеток-мишеней при отсутствии эффекторных клеток. Сокультивирование только с NK-клетками снизило выживаемость клеток-мишеней примерно до 70%, что указывает на базовую естественную цитотоксичность. Добавление даратумумаба привело к дальнейшему снижению выживаемости клеток примерно до 37%, что согласуется с усилением антителозависимой цитотоксичности.

Напротив, в контрольном условии с изотипом выживаемость составила примерно 62%, что сопоставимо с условием, содержащим только NK-клетки. Дегрануляция NK-клеток была минимальной в кокультуре NK-клеток и клеток-мишеней без антител и максимальной в условии с применением даратумумаба — примерно 31%, в то время как в контроле с изотипом наблюдалась промежуточная дегрануляция на уровне примерно 19%. Данный протокол позволяет исследователям количественно определить естественную цитотоксичность NK-клеток, оценить эффективность уничтожения опухолевых клеток различными конструкциями CAR-NK и сравнить эффективность ADCC моноклональных антител. Ключевым аспектом при выполнении этого протокола является обеспечение точного и последовательного подсчета, пипетирования и посева NK-клеток и клеток-мишеней для получения надежных и интерпретируемых результатов.

В будущих исследованиях данные протоколы могут быть использованы для изучения механизмов уклонения от иммунного ответа NK-клеток, сравнения чувствительности опухолей и оценки новых методов иммунотерапии на основе NK-клеток при различных видах рака.