Строительство и Имплантация Microinfusion системы для устойчивой доставки агентов Neuroactive.

Здравствуйте, меня зовут Майлз Каннингем. Вместе с Райаном О'Коннором и Сидни Вонг мы продемонстрируем создание системы микроинфузии для непрерывного введения нейроактивных веществ. Эта работа была выполнена в лаборатории нейрореконструкции больницы Маклин при Гарвардской медицинской школе.

Мы хотели бы поблагодарить Sydney rbe Foundation и Narsad за их щедрую поддержку. Мы обнаружили, что нейроактивные агенты могут быть надежно доставлены в отдельные области мозга с помощью вытянутой микроканюли из боросиликатного стекла с диаметром кончика в 5–10 раз меньше, чем у обычных канюль для доставки. На этом слайде мы показываем широко используемую инфузионную канюлю из нержавеющей стали рядом с микроканюлей, которую мы изготовили здесь, в нашей лаборатории.

Такое уменьшение размера канюли для введения приводит к значительному снижению травматизации исследуемой области мозга. Многие традиционные методы фактически вызывают повреждение в области интереса или внутри нее, что ставит под сомнение достоверность любого результата. На панели A вы можете видеть степень повреждения локальной области, вызванного канюлей диаметром 0,32 мм, по сравнению с канюлей 50 мкм на панели B. Эти фотографии с малым увеличением представляют собой влажные препараты неокрашенных срезов мозга крыс линии Vibram.

Затем эти же срезы были окрашены гематоксилином и эозином, и их снимки были получены при большем увеличении. Чтобы дополнительно продемонстрировать снижение повреждения тканей при использовании микроканюли, представлены компоненты системы микроинфузии: мини-осмотическая помпа zet с модулятором потока из нержавеющей стали, у которого удален фланец. Также используются два-три сантиметра полиэтиленовой трубки, изготовленная на заказ боросиликатная микроканюля и направляющая проволока 28-го калибра; это собранная система микроинфузии, готовая к имплантации.

Для изготовления микроканюль с заданными характеристиками здесь используется стандартный вертикальный вытягиватель. Также подходят горизонтальные вытягиватели. Боросиликатная трубка позиционируется и закрепляется путем изменения температуры нагревательного элемента и натяжения стержня.

Вы можете надежно изготавливать микроканюли с определенным диаметром и длинными конусными стержнями. Кварцевые трубки Bora нагревают и подвергают легкому давлению, чтобы придать трубке необходимый изгиб. Этот изгиб делается на расстоянии от кончика микроканюли, которое соответствует глубине целевой области мозга с учетом необходимого зазора над черепом.

Конечная длина дистальной трубки этой микроканюли в месте изгиба составляет примерно 9–10 мм. Видимо, не удовлетворившись результатом, Райан повторно вводит микроканюлю, чтобы произвести точную настройку и довести угол изгиба до идеала.

Использование алмазного резца дает гораздо лучший результат. Сидни демонстрирует метод разрезания боросиликатной трубки примерно в пяти миллиметрах проксимальнее изгиба, плотно прижимая трубку к твердой поверхности так, чтобы дистальная часть микроканюли свободно свисала с края. Она делает круговой надрез на трубке.

Затем, приложив легкое давление, она аккуратно переламывает трубку по насечке на интерфейсе. Тонкий прозрачный кончик канюли можно окрасить перманентными чернилами для облегчения визуализации. В ходе хирургической операции под увеличением кончик микроканюли обрезают микродиссекционными ножницами до достижения требуемого диаметра.

Диаметр кончика можно проверить с помощью окуляра или микроскопа. Проволоки для радиального выравнивания изготавливают из нержавеющей стали калибра 28, разрезая ее на отрезки длиной примерно три сантиметра. Затем с помощью пинцета на конце каждой проволоки формируют небольшой крючок диаметром около двух миллиметров.

Проволока для центрирования помещается в чашку Петри вместе с отрезками полиэтиленовых трубок длиной два-три сантиметра в микроканюлях. Систему микроинфузии можно собрать с помощью инструментов, имеющихся в большинстве лабораторий. Микропинцеты, обычные пинцеты, хирургические ножницы и гемостаты помещаются в хирургическую салфетку для стерилизации.

Инструменты, компоненты системы микроинфузии, а также несколько листов алюминиевой фольги стерилизуют в стандартном автоклаве. Модулятор потока осторожно извлекают из упаковки и помещают в стерильную чашку Петри. Его надежно фиксируют гемостатами, после чего с помощью ножниц удаляют пластиковый фланец из трубки модулятора из нержавеющей стали.

Мини-осмотическая помпа также извлекается из упаковки и помещается в стерильную чашку Петри. Трубка из нержавеющей стали вставляется в полиэтиленовую трубку примерно на два-три миллиметра, после чего обе трубки герметизируют с помощью светоотверждаемого эпоксидного клея. Для проведения деликатных работ мы используем клей Lummi bond из нашей нейробиологической лаборатории: заполняем шприц объемом 1 CC клеем Lummi bond и используем иглу 27G в качестве аппликатора; под воздействием яркого света Lumon отвердевает всего за несколько секунд.

Мини-осмотический насос заполняют, удерживая его в вертикальном положении и осторожно вводя раствор с помощью иглы для заполнения, прилагаемой производителем. Мы рекомендуем контролировать объем вводимой в насос жидкости и/или взвешивать насос до и после заполнения, чтобы убедиться, что он заполнен полностью и не имеет дефектов. Обратите внимание, что мы не рекомендуем использовать насосы повторно.

Затем полный модулятор с прикрепленной к нему полиэтиленовой трубкой вставляется в мини-осмотический насос. При вставке пенного модулятора жидкость из насоса будет вытесняться в полиэтиленовую трубку. Необходимо отметить начальную длину заполненного жидкостью участка полиэтиленовой трубки; следует наблюдать за увеличением этой длины после активации насоса в условиях инкубации в стерильном физиологическом растворе при 39 °C по истечении 12 часов инкубации.

Активированный мини-осмотический насос погружают в стерильный физраствор, который обеспечивает среду без воздуха для завершающих этапов сборки системы микроинфузии. Шприц, оснащенный пластиковой трубкой малого диаметра и заполненный тем же раствором, что и насос, используют для вытеснения воздуха из незаполненной части полиэтиленовой трубки. Обратите внимание, что воздух из микроканюли также должен быть вытеснен.

Аналогичным образом, дистальный конец полиэтиленовой трубки может потребовать расширения с помощью микропинцета, после чего в него вставляют проксимальный конец микроканюли. Теперь вся система очищена от воздуха и мертвого пространства; ее можно извлечь из солевого раствора и просушить стерильной марлей. Затем наносят Luma bond для фиксации микроканюли в полиэтиленовой трубке. Чтобы снизить скорость потока мини-осмотической помпы примерно в два раза, в небольшое чашко-чашку Петри наливают стерильный горячий парафин и на короткое время погружают в него проксимальную половину мини-осмотической помпы.

Излишки парафина удаляют промоканием, после чего систему для микроинфузии возвращают в стерильный физиологический раствор и хранят до начала операции. Непосредственно перед хирургической имплантацией направляющий провод фиксируют на изгибе микроканюли.

Продольная ось направляющей проволоки выравнивается по той части микроканюли, которая будет вводиться в ткани мозга, и фиксируется люмоном в этом положении. После этого систему микроинфузии можно установить на манипулятор стереотаксического прибора.

Направляющая проволока фиксируется зажимом манипулятора, а насос привязывается сверху петлей стерильной шовной нити. Это позволит удерживать его вес и обеспечит идеальное выравнивание микроканюли перпендикулярно поверхности черепа; после осторожного изгибания направляющей проволоки пинцетом систему микроинфузии можно имплантировать с использованием стандартной стереотаксической процедуры. Трубка Боэля фиксируется на поверхности черепа с помощью адгезива.

Мы используем дентинный материал Jaron для формирования пьедестала с низким профилем. Затем излишек направляющей проволоки, выступающий над местом подготовки, срезают вровень с поверхностью пьедестала. С помощью режущего колеса, закрепленного на высокоскоростной дрели, мини-осмотическую помпу можно разместить подкожно в области лопатки животного.

Данный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами. Он может быть адаптирован под конкретный вид и возраст экспериментального животного. Кварцевую трубку можно придать форму, соответствующую поверхности черепа животного.

Таким образом, обеспечение надежной низкопрофильной фиксации исключает необходимость в использовании большого краниального пьедестала; хирургическая рана может быть легко закрыта поверх обтекаемого пьедестала для микроинфузии, что снижает риск инфекции и дискомфорт для животного, а для закрепления системы на черепе требуется меньшая площадь поверхности. Следовательно, дополнительные или последующие процедуры могут быть выполнены без помех со стороны массивного пьедестала. Однако самое важное заключается в том, что данный метод снижает инвазивность и травматизацию локальной среды в месте инфузии, минимизируя тем самым эффект наблюдателя.

Это те изменения, которые активное наблюдение вносит в наблюдаемый феномен.