Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Митохондрии выполняют многочисленные функции в физиологии клетки: от метаболизма и выработки энергии до программируемой гибели клеток и синтеза стероидных гормонов. Несмотря на важность митохондрий как для основных клеточных функций, так и для развития заболеваний, о функционировании митохондрий в эмбриональных стволовых клетках человека и их дифференцированных потомках известно очень мало. В этом видео мы продемонстрируем, как можно анализировать комплексы дыхательной цепи митохондрий стволовых клеток человека с помощью анализа активности по методу Ингеля.

Здравствуйте, я Иван ОВ из лаборатории Майкла Тетеля кафедры патологии и лабораторной медицины Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру оценки функции митохондриальных дыхательных комплексов в эмбриональных стволовых клетках человека. Данный метод анализа активности в геле включает выделение грубого митохондриального осадка из эмбриональных стволовых клеток человека, разделение комплексов митохондриальной системы окислительного фосфорилирования с помощью высокоразрешающего электрофореза в прозрачном нативном полиакриламидном геле и последующий анализ активности в геле.

Итак, приступим. Первый этап данной процедуры — выделение митохондрий из эмбриональных стволовых клеток человека. Для этого анализа мы будем использовать эмбриональные стволовые клетки человека, выращенные на планшете, покрытом Matrigel, в бесфидерных условиях.

Для выделения митохондрий из наших стволовых клеток человека мы начинаем с их промывки теплым 1x PBS pH 7.4, после чего обрабатываем клетки трипсином в течение пяти минут. В лунке 6-луночного планшета можно использовать 1 mL 1x трипсина. Через пять минут реакцию останавливают, добавляя равный объем свежего ингибитора трипсина (1 mg/mL в 1x PBS), и собирают клетки.

Собранные клетки затем центрифугируют при 200 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования удаляют супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 0,8–1,7 мл ледяного буфера для выделения митохондрий с добавлением свежеприготовленного коктейля ингибиторов протеаз 1×. Объем используемого буфера зависит от размера полученного осадка клеток. После ресуспендирования осадка его выдерживают на льду около 10 минут.

После инкубации мы разрушаем клетки с помощью гомогенизатора; для этого может потребоваться примерно 40–50 проходов. Чтобы убедиться в полноте гомогенизации, можно окрасить аликвоту клеток DOD трипановым синим и изучить её под световым микроскопом. Результат должен выглядеть примерно так.

Это первый прогон после 50 нажатий пестиком. Это второй прогон после 80 нажатий пестиком. После гомогенизации клеток центрифугируйте их при 20 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. В результате получится грубый осадок митохондрий, который также будет содержать ядра и более крупные фрагменты клеток.

Перед сбором осадка необходимо взвесить пробирку, чтобы оценить последующий вес осадка, слить и удалить супернатант, а затем взвесить осажденный грубый митохондриальный осадок. Вычтя вес пробирки на этом этапе, можно приступить к сольватации осадка, что будет показано на следующем шаге. Для сольватации грубого митохондриального осадка следует держать осадок на льду и перемешать его на вортексе с 35 µL ледяного буфера для сольватации.

Для каждых 20 мг осадка подробная информация о составе буферных соединений приведена в сопроводительном письменном протоколе. После вортексирования и добавления буфера для солюбилизации, но до добавления дигитонина, перенесите ресуспендированный осадок в пробирку, подходящую для высокоскоростного центрифугирования, затем добавьте 20 µL 10% (масса/объем) дигитонина на каждые 20 мг веса осадка и перемешайте, слегка встряхнув пробирку; после тщательного перемешивания инкубируйте митохондриальный осадок от 5 до 10 минут на льду. Для солюбилизации белков вместо дигитонина можно использовать DDM или Triton X 100.

Выбор детергента и его количество могут повлиять на образование супракомплексов или мультимерных форм митохондриальных комплексов после инкубации на льду. После солюбилизации осадка мы центрифугируем его при 100 000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C, после чего собираем прозрачный супернатант. Теперь мы готовы подготовить супернатант для нанесения на градиентный гель для проведения нативного градиентного гель-электрофореза митохондрий.

Мы рекомендуем использовать градиентный акриламидный гель от 5% до 13% с концентрирующим гелем 3,5%. Для приготовления геля мы будем использовать смесь акриламида и бисакриламида, как описано в письменном протоколе. Раствор акриламида и бисакриламида готовится заранее и хранится при температуре 4 °C в темном месте.

Акриламид и бисакриламид являются токсичными химическими веществами как в виде порошка, так и в жидкой форме, поэтому при работе с ними следует соблюдать особую осторожность. Мы смешиваем раствор акриламида и бисакриламида с аликвотой трехкратного гелевого буфера, состоящего из 1.5 M 6-аминогексановой кислоты и 75 mM OLE при pH 7.0. Количество раствора акриламида и бисакриламида, добавляемого в буфер, зависит от требуемого процента содержания геля для создания градиентного геля.

Мы приготовим одну смесь с концентрацией 4% и одну смесь с концентрацией 13%, а концентрирующий гель будет представлять собой смесь 3,5%. Не забудьте добавить глицерин в смесь 13%. Когда все три смеси будут готовы, мы добавим в них соответствующее количество персульфата аммония и TEMED, после чего зальем смеси в камеру для формирования градиента.

В левой части камеры находится 5% смесь. В правой части камеры находится 13% смесь с небольшим магнитным перемешивающим элементом. Мы начинаем заливать гель, открыв правую часть камеры.

Затем мы немедленно открываем левую часть камеры и позволяем 5%-ному раствору смешаться с 13%-ным раствором для создания градиента. Мы добавляем небольшое количество изопропанола на поверхность геля, чтобы после полимеризации сформировалась четкая ровная граница геля. Примерно через один час, когда полимеризация градиентного геля завершится, мы удаляем изопропанол, заливаем в аппарат 3,5% стакинг-гель и вставляем гребенку.

Сборка и электрофорез гелей будут проводиться в холодильной камере при температуре примерно от четырех до семи градусов Цельсия. Для проведения этого анализа будут использоваться два различных буфера. В анодной камере будет применяться буфер, содержащий 25 мМ HCl pH 7.0.

Катодный буфер будет содержать 50 мМ ТРИС, 7,5 мМ соляной кислоты, 0,02% (масс./об.) DDM (n-додецил-β-D-мальтозида) и 0,05% (масс./об.) дезоксихолата при pH 7,0. Для подготовки супернатанта к нанесению на только что залитый гель добавляют буфер для нанесения до конечной концентрации 5% (масс./об.) глицерина и 0,01% (масс./об.) Ponto S; обычно мы добавляем 10-кратный стоковый раствор, содержащий глицерин и Ponto S, непосредственно в супернатанты.

Теперь мы готовы нанести образец на гель. В лунки геля загружают объем, содержащий от 20 до 40 миллиграммов неочищенного митохондриального белка на дорожку. Сразу после нанесения гель запускают при напряжении 100 вольт.

После того как образец войдет в концентрирующий гель, напряжение можно повысить до 500 вольт при ограничении силы тока до 15 миллиампер. Хотя обычно мы проводим электрофорез в течение ночи при 70–100 вольтах, мы останавливаем процесс, когда четкая линия красного красителя zos приближается к фронту геля. Теперь, когда разделение в геле завершено, можно анализировать активность различных белковых комплексов непосредственно в геле.

Время инкубации для каждого анализа зависит от эффективности солюбилизации белков и количества материала, внесенного в каждую лунку. Комплексы один, четыре и пять обычно дают более сильные сигналы, чем комплексы два и три. Именно поэтому время окрашивания для комплексов два и три должно быть более длительным.

Для проверки активности комплексов потребуется использовать специфические буферы для каждого из них. Состав отдельных буферов указан в письменном протоколе. Теперь мы вырежем отдельные дорожки геля, чтобы провести анализы активности in-gel независимо друг от друга.

Для всех комплексов, за исключением пятого, инкубируйте фрагмент геля в соответствующих буферах в течение нескольких часов при комнатной температуре. После инкубации зафиксируйте гель в 50% метаноле и 10% уксусной кислоте в течение 15–45 минут. Зафиксированный гель хранят в 10% уксусной кислоте.

Здесь показано, как выглядит окрашивание комплекса I. В срезе геля видна одна темно-фиолетовая полоса, соответствующая комплексу I. Прозрачные гели позволяют проводить денситометрию для определения активности митохондриальных комплексов и выполнять сравнительный анализ.

После проведения плотной цитометрии мы обычно высушиваем срезы геля для длительного хранения и/или для сканирования с целью получения высококачественного изображения. Комплекс два и два красителя имеют один и тот же пурпурный цвет, тогда как комплекс три и комплекс четыре окрашиваются в оранжевый или желтоватый цвет. Ниже приведены примеры активности окрашивания комплексов два, три и четыре.

Мы только что продемонстрировали вам способ анализа активности митохондриальных эксудативных комплексов, которые были экстрагированы из эмбриональных стволовых клеток человека и разделены с помощью методов высокого разрешения, включая нативный гель-электрофорез. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в проведении вашего эксперимента.