Неинвазивная 3D-визуализации с суб-микронных Резолюция Использование синхротронного рентгеновского томографии
27 мая 2008 г.
Мы использовали синхротронное рентгеновской томографии в радиационной европейских синхротронного Facility (ESRF) для неинвазивного производить 3D-томографических данных с пиксель-разрешением 0.7μm. Используя программное обеспечение объема рендеринг, это позволяет реконструкция внутренних структур в их естественном состоянии без артефактов производства гистологических срезов.
Здравствуйте. Меня зовут Мишель Ов, я представляю лабораторию рукокрылых Университета Тюбингена, и в данной презентации я хочу рассказать о неинвазивной трехмерной визуализации внутренней организации микроскопических тихоходок с использованием синхротронной рентгеновской томографии с субмикронным разрешением. Модельной системой, с которой мы работаем, является клещ-орбитовик *Apus longosis*, микроскопический представитель группы Eutardigrada с размером тела от 800 µm до 1 mm. На этом снимке, сделанном из лабораторной культуры, видно, как животные питаются водорослями.
Для изучения внутреннего строения Argos мы используем синхротронное рентгеновское излучение для получения томографических VOX-данных в SRF и Grable. Здесь представлена фотография ESRF с большим накопительным кольцом, а в правом верхнем углу — экспериментальный зал ID 19, расположенный за пределами кольца. Для проведения измерений образцы были центрированы и закреплены на пластиковых штифтах с помощью суперклея. Эксперименты проводились при энергии 20.5 KEV; для реконструкций было сделано 1 500 проекций.
Здесь представлена камера с ПЗС-матрицей с ко-фриланс архитектурой, 14-битным динамическим диапазоном и разрешением четыре мегапикселя. Сцинтиллятор, показанный в нижней части этого изображения, преобразует рентгеновское излучение в видимый свет. На снимке представлен крупный план держателя образца и поворотного стола.
Образец закрепляется в головке измерителя Goya для обеспечения правильной ориентации образца в пучке. Подробное описание экспериментальной установки приведено в нашей статье 2007 года в журнале Journal of Microscopy. В данной презентации я сосредоточусь на анализаторах данных применительно к трехмерной визуализации с использованием программного обеспечения Fiji Studio Max.
Сначала я покажу вам, как удалить серые значения фона для извлечения информации об образце. На гистограмме виден один большой пик, который относится преимущественно к серым значениям фона. После удаления этого пика из гистограммы можно увидеть, как образец выделяется из серого куба.
Далее я покажу вам, как вращать объект с помощью инструментa key framer в VG studio. В программе Max есть набор предопределенных траекторий камеры. Здесь я использую XY circle для создания вращения вокруг вертикальной оси Xs, и вот полученная в итоге анимация.
Крупная структура на спине животного соответствует поверхности суперклея. Теперь я покажу вам, как установить виртуальную плоскость сечения, чтобы иметь возможность трехмерно рассмотреть внутреннюю организацию образца. Существует три ориентации, в которых может быть установлена плоскость сечения: фронтальная, сагиттальная и аксиальная.
Здесь я использую фронтальную плоскость и выбираю позицию среза где-то посередине животного, в области; эта плоскость среза не обязательно должна быть статичной. Снова используя инструмент ключевых кадров, её можно перемещать по любой оси. В данном примере я использую предустановленный клип Z, чтобы переместить плоскость среза вдоль продольной оси образца; так выглядит итоговая анимация шаг за шагом, позволяя проследить 3D-организацию всех внутренних структур с разрешением P всего 0.7 microns.
Помимо предопределенных траекторий камеры, можно создавать пользовательские пути перемещения камеры. Для этого выберите режим свободного обзора (free camera look at) и установите камеру, а также фокусное расстояние виртуального объектива в любое желаемое положение. Пошагово можно определять новые позиции камеры, чтобы создать индивидуальный маршрут любой сложности.
3D-окно в верхнем левом углу в режиме реального времени отображает результат применения всех настроек камеры. В заключительном примере вас ждет виртуальный полет по всей пищеварительной системе животного. Здесь видны некоторые части gma, colliery, лабрума и ротеллы.
Мы приближаемся и entering в ротовую полость животного. Здесь видны PHN на дорсальной стороне. Теперь мы проходим через пищевод, чтобы попасть в желудочки.
Наши клещи имеют два крупных кер. Это слизистые структуры с пищеварительной функцией. Мы вводим правую сеум.
Через маленькое отверстие можно увидеть многочисленные клетки IDE. Они играют важную роль в пищеварении, хотя их полная функция и механизм до конца еще не изучены. Возвращаясь к желудочкам, мы видим определенную структуру — клапан Изаля, через который мы вошли в желудочки минуту назад, прямо на границе желудочков и ободочной кишки.
Вы видите пищевой комок, который уплотнен и окружен атрофированной мембраной. Позади пищевого комка видна фекальная пеллета. В данный момент мы пролетаем сквозь эту фекальную пеллету.
После этого мы прошли через короткую часть поперечной ободочной кишки и вошли в нисходящую ободочную кишку. Здесь вы видите крупную и характерную микробиоту. Наконец, здесь можно увидеть внутреннюю поверхность отдельных животных пластинок, напоминающих палитру.
Мы заканчиваем изучение пищеварительной системы. Теперь мы в последний раз кратко рассмотрим внешнюю вентральную сторону животного, чтобы увидеть анальные пластинки (AAL-пластинки) и генитальные пластинки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен неинвазивный метод визуализации внутренней организации выходов микро-AHR с использованием синхротронной рентгеновской томографии. Этот метод позволяет получать 3D-изображения с высоким разрешением без артефактов, характерных для традиционных гистологических методов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы визуализации
- Микробиология
Введение
- Объекты микро-AHR представляют собой маленьких организмов, требующих детального внутреннего анализа.
- Традиционные методы визуализации могут привносить артефакты, которые скрывают истинные структуры.
- Синхротронная рентгеновская томография предлагает решение с высоким разрешением.
- Исследование сосредоточено на клеще Aus Long osis как модельном организме.
Цель исследования
- Для визуализации внутренних структур микро-выходов AHR.
- Для демонстрации эффективности синхротронной рентгеновской томографии.
- Для получения данных об организации этих малых организмов.
Используемые методы
- Синхротронная рентгеновская томография на базе Европейского центра синхротронного излучения (ESRF).
- Образцы подвергали сушке в критической точке, после чего закрепляли для получения изображений.
- Визуализация проводилась при энергии 20.5 KEV с получением 1 500 проекций.
- Для реконструкции данных использовали программное обеспечение для объемного рендеринга.
Основные результаты
- 3D-томографические наборы данных были получены с разрешением пикселя 0,7µm.
- Внутренние структуры были реконструированы в их естественном состоянии.
- Данный метод позволил избежать появления артефактов, характерных для гистологического секционирования.
- Визуализация позволила по-новому взглянуть на организацию выходов микро-AHR.
Выводы
- Синхротронная рентгеновская томография является мощным инструментом для неинвазивной визуализации.
- Данный метод расширяет наше понимание мелких биологических структур.
- В будущих исследованиях этот метод можно использовать для различных приложений в биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Неинвазивная 3D-визуализация с субмикронным разрешением позволяет проводить детальный анализ внутренней структуры биологических систем микромасштаба без деструктивного сечения. Этот подход способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах поиска лекарств, предоставляя количественные морфологические данные в нативном состоянии. Данный метод повышает прогностическую достоверность фенотипического скрининга и разработки анализов в моделях соответствующих заболеваниям, где традиционная гистология оказывается неэффективной из-за размера образцов или артефактов подготовки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью 3D-реконструкции внутренних систем органов на моделях микроартропод.
- Практическая ценность: обеспечивает неразрушающую визуализацию уникальных или ограниченных образцов, сохраняя материал для последующих анализов.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет визуализации функциональной анатомии и организации тканей без артефактов, возникающих при секционировании.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет создавать количественные наборы данных морфологии с разрешением пикселя 0,7µm для точного фенотипирования и структурного сравнения.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые рабочие процессы объемного рендеринга с использованием траекторий камеры по ключевым кадрам и виртуальных секущих плоскостей.
- Готовность анализа: Облегчает визуализацию целостных систем органов (например, пищеварительного тракта) для обоснования выбора биомаркеров и разработки функциональных показателей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает продольное отслеживание внутренних структур в системах, имеющих значение для заболевания, с помощью анимированной 3D-визуализации.
- Механистическая минимизация рисков: выявляет скрытые анатомические особенности (например, внутриклеточные структуры, механизмы работы клапанов) для прояснения патофизиологических путей.
- Доклиническая согласованность: поддерживает принятие решений о продвижении с учетом рисков, обеспечивая структурную валидацию без артефактов в различных модельных системах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска в качестве этапа неразрушающей визуализации после подготовки образцов и перед разработкой функционального анализа, что позволяет итеративно проектировать исследования по валидации мишеней.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей посредством выявления внутренней организации биологических систем микромасштаба.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных 3D-данных, подходящих для платформ высококонтентного скрининга, требующих субклеточного разрешения.
- Аналитика: позволяет извлекать морфометрические ориентиры и объемные измерения для статистического сравнения различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: способствует доклинической валидации, предоставляя структурные данные в нативном состоянии, которые коррелируют с функциональными фенотипами.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования средств визуализации для применения в различных проектах на модельных системах микроорганизмов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет устранения гистологических артефактов и сохранения нативной ультраструктуры.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам синхротронного излучения и программным конвейерам визуализации.
- Стратегическая ценность: Снижает риск неудач на поздних стадиях за счет обеспечения раннего обнаружения структурных аномалий в моделях ведущих кандидатов.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе надежных количественных структурных данных в соответствующих микромоделях заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области безопасности при использовании синхротронного излучения, томографической реконструкции и программного обеспечения для визуализации объемов (например, Fiji, VG Studio Max).
- Зависит от доступа к синхротронным установкам (например, ESRF) с возможностями каналов для получения изображений с субмикронным разрешением при энергии 20.5 keV.
- Необходима межкомандная стандартизация подготовки образцов (критическая сушка, монтирование) и параметров визуализации (1 500 проекций, протоколы вращения).
- Требуется адаптация с учетом различий в плотности образцов, твердости кутикулы и средах монтирования для разных видов микроартропод.
- Ограничено требованиями к размеру образца (<1 mm) и необходимостью использования радиационно-стабильных экземпляров при длительном воздействии пучка.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:18
Introduction
0:38
X-ray radiation tomographic measurements
2:08
Removing the background and extracting the sample information
2:38
Rotating the object using the keyframer
3:25
Setting the virtual plane
4:06
Moving the slice through the object using the keyframer
4:45
User specific camera paths
5:23
Following the digestive system through the whole animal
