Нейтрофилов Изоляция протокола

Протокол выделения нейтрофилов. В данной процедуре будут выделены лейкоциты из образца цельной крови с использованием центрифуги и пробирок. Вортекс, игла и шприц, шприцевой фильтр.

Материалы: фильтры Millipore бренда MX gv 0,22 мкм. Для разделения нейтрофилов в растворе Хэнкса и солевом растворе требуются два вида растворов HBSS. HBSS с хлоридом кальция будет использоваться для приготовления раствора с человеческим сывороточным альбумином.

Для суспендирования и промывки нейтрофилов будет использоваться HBSS без хлорида кальция. Пожалуйста, уделите особое внимание использованию соответствующего раствора HBSS в данной процедуре. Альбумин сыворотки человека или HSA представляет собой белок плазмы крови, который поддерживает pH и осмотическое давление.

Не используйте буфер для лизиса эритроцитов bovine serum amalgamate. Данный препарат производится компанией Roche Diagnostics; среда для изоляции нейтрофилов NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly для сепарации должна быть защищена от света и храниться в холодильнике для достижения наилучших результатов. Все реагенты перед использованием должны быть доведены до комнатной температуры.

За один час до начала эксперимента извлеките реагенты из холодильника. Приготовьте раствор H-B-S-S-H-S-A для выделения нейтрофилов. Перенесите HBSS с хлоридом кальция в пробирку с помощью пипетки.

Наберите HSA в шприц. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Снимите иглу шприца и замените ее фильтром.

Введите HSA через фильтр в пробирку с HBSS, перемешайте на вортексе. Когда остальные материалы будут готовы и достигнут комнатной температуры, возьмите около 15 миллилитров цельной крови. Это позволит получить от 10 до 15 миллилитров суспензии нейтрофилов с концентрацией 10⁸. Донор не должен употреблять алкоголь или безрецептурные лекарственные препараты в течение 24 часов до забора образца крови.

Эти факторы могут нарушить процесс разделения. Цельную кровь можно антикоагулировать с помощью ЭДТА, цитрата или гепарина, добавляя девять частей крови к одной части K₃ЭДТА, цитрата натрия или гепарина в соответствии с инструкциями производителя. В данной процедуре будут описаны следующие этапы.

Отделите и удалите плазму и моноциты. Выделите слой нейтрофилов, подвергнув эритроциты лизису, и получите суспендированные нейтрофилы после первого разделения. Соберите нейтрофилы из слоя NIM.

Налейте пять миллилитров среды для изоляции в центрифужную пробирку. Расположение среды для изоляции в нижней части пробирки позволяет ей выполнять функцию фильтра, так как при центрифугировании кровь будет принудительно проходить сквозь нее. Осторожно нанесите пять миллилитров крови поверх NIM для обеспечения четкого разделения.

Будьте предельно осторожны, чтобы не допустить смешивания растворов. Выполняйте этот этап медленно и аккуратно, удерживая наконечник пипетки близко к поверхности разделяющей среды, чтобы предотвратить перемешивание. Центрифугируйте раствор при 500 RCF в течение 35 минут.

При температуре от 20 до 25 °C кровь должна разделиться на шесть четких слоев. Этими слоями являются плазма, моноциты, изолирующая среда, нейтрофилы, снова изолирующая среда и осадок эритроцитов на дне. Если эти шесть слоев не выражены четко, значит, процесс разделения прошел некорректно и процедуру необходимо повторить.

Распространенными причинами плохого разделения являются использование просроченных сред для изоляции, употребление донором алкоголя в течение последних 72 часов или прием других лекарственных средств, таких как Tylenol или аспирин. Осторожно удалите и утилизируйте плазму, моноциты и среду для изоляции. Поместите эти слои в герметичную пробирку и утилизируйте; осторожно перенесите пипеткой слой нейтрофилов и всю среду для изоляции, находящуюся под нейтрофилами, в чистую центрифужную пробирку, чтобы собрать максимально возможное количество нейтрофилов.

Часто проще всего захватить также часть изолирующей среды из слоя ниже. Не заденьте осадок на дне. Второе перемещение, очистка слоя нейтрофилов.

Доведите объем раствора нейтрофилов до 10 миллилитров, добавив HBSS без кальция. Несколько раз переверните пробирку, чтобы суспендировать клетки. Центрифугируйте раствор нейтрофилов.

Центрифугируйте при 350 RCF в течение 10 минут. При температуре от 20 до 25 °C на дне пробирки должен образоваться красный осадок, содержащий нейтрофилы и остаточные эритроциты. Удалите супернатант с помощью пипетки.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок на дне при лизисе эритроцитов.

Теперь необходимо разрушить эритроциты в образце путем лизиса. Для лизиса остаточных эритроцитов добавьте в пробирку два миллилитра буфера для лизиса эритроцитов для ресуспендирования. Ресуспендируйте осадок, перемешивая пробирку на вортексе при настройке от трех до четырех.

Избегайте увеличения интенсивности перемешивания на вортексе выше уровня четыре, так как это может привести к активации нейтрофилов. Для растворения осадка может потребоваться перемешивание в течение нескольких секунд или использование импульсного режима вортекса. Центрифугируйте раствор для лизиса при 250 RCF в течение пяти минут.

Используйте функцию плавного пуска для минимизации повреждения образца. Удалите супернатант с помощью пипетки. Повторите процесс лизиса.

При необходимости, для ресуспендирования нейтрофилов добавьте в каждую пробирку 500 µL HBSS без кальция. Перемешайте осадок на вортексе при режиме от трех до четырех, разбавьте до 10 mL HBSS без кальция и центрифугируйте. Центрифугируйте нейтрофилы при 250 RCF в течение пяти минут, затем аспирируйте и удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок в 250 µL раствора HBSS с HSA; обычно собирают 2×10⁶ нейтрофилов на мл.