Trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих

Технология культивирования тканей нашла широкое применение в области клеточной биологии. Однако для поддержания жизнеспособности культивируемые клетки требуют регулярного ухода. По достижении клетками конфлюэнтности их необходимо подвергнуть субкультивированию или пассажированию.

Несоблюдение этого требования приводит к замедлению роста и, в конечном итоге, к гибели клеток. В данном видео мы демонстрируем способы поддержания культур тканей как для адгезивных, так и для суспензионных клеточных линий. Здравствуйте, меня зовут Рики, я нахожусь в лаборатории доктора LAN в сети лабораторий молекулярной патологии в Восточном Теннесси.

Сегодня я хочу продемонстрировать вам две методики пассирования суспензионных и адгезивных клеток. Для пассирования клеток из планшета нам понадобится первичная культура, выращенная до полной конфлюэнтности в чашке Петри диаметром 60 мм или в флаконе для культивирования тканей объемом 25 см², содержащем 5 мл среды для культивирования тканей.

Сначала с помощью стерильной пипетки удаляют всю среду из первичной культуры. Затем прилипший монослой клеток один или два раза промывают небольшим объемом HBSS без кальция и магния при температуре 37 °C. Это необходимо для удаления остатков фетальной бычьей сыворотки, которая может ингибировать действие фермента трипсина, добавляемого на следующем этапе.

Затем добавьте в культуру достаточное количество подогретого раствора трипсина-ЭДТА, чтобы полностью покрыть слой адгезивных клеток. После этого поместите планшет на нагревательный столик при температуре 37 °C на одну-две минуты. По завершении инкубации аккуратно постучите по дну планшета о плоскую поверхность, чтобы открепить клетки.

Проверьте культуру с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что клетки округлились, что указывает на их открепление от поверхности. Если клетки открепились недостаточно, верните планшет в термостат еще на одну или две минуты. После осмотра под микроскопом промойте чашку полной средой и перенесите суспензию пипеткой в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл полной среды.

Центрифугируйте клетки для получения осадка, затем ресуспендируйте осадок в полной среде. Теперь добавьте равный объем клеточной суспензии в каждую из новых соответствующим образом промаркированных планшетов. В качестве альтернативы клетки можно подсчитать с помощью гемоцитометра и развести до нужной плотности, чтобы в каждый планшет было добавлено определенное количество клеток.

Обязательно пометьте каждую чашку датой пересева и номером пассажа. После добавления клеточной суспензии добавьте по 1 мл свежей среды в каждую новую культуру. Затем инкубируйте чашки в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.

После инкубации клеток в течение ночи добавьте в планшеты свежую среду и верните их в инкубатор при 37 °C. Когда клетки достигнут состояния слияния (конфлюэнтности), вы можете снова провести пассаж, повторив эту процедуру, и продолжать пассировать клетки по мере необходимости. Теперь мы покажем вам, как проводить пассаж клеток в суспензионной культуре.

Пассирование клеток, находящихся в суспензионной культуре, проще, чем для адгезивных клеток. Перед пассированием суспензионных культур клетки необходимо поддерживать, добавляя свежую питательную среду каждые два-три дня, до достижения конфлюэнтности — состояния, при котором клетки в суспензии слипаются в агрегаты, а среда при перемешивании колбы становится мутной.

Для этого извлеките колбу с суспензией клеток из инкубатора, стараясь не потревожить клетки, осевшие на дно колбы. В асептических условиях удалите и утилизируйте примерно одну треть среды из колбы и замените ее равным объемом предварительно нагретой до 37 °C среды. После замены среды осторожно перемешайте содержимое колбы круговыми движениями и верните ее в инкубатор с параметрами 37 °C и 5% CO2.

Если в колбе содержится менее 15 мл среды, инкубируйте её в горизонтальном положении для улучшения контакта клеток со средой. В противном случае в дни, когда подкормка культур не проводится, колбу можно инкубировать вертикально. Проверяйте состояние культур, аккуратно перемешивая содержимое колб круговыми движениями для ресуспендирования клеток.

Обязательно следите за любыми изменениями цвета среды, которые указывают на активный метаболический рост. После того как культуры достигнут конфлюэнтности, что соответствует примерно 2,5 million cells per mil, их можно пересевать. Таким образом, мы продемонстрировали способ пересева культивируемых клеток как для адгезивных, так и для суспензионных культур.

На этом всё. Спасибо за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.