Окрашивание белков в гелях

В предыдущем видео под названием «Электрофоретическое разделение белков» мы продемонстрировали, как можно разделить сложную смесь белков с помощью гель-электрофореза. В этом видео мы покажем вам четыре различных метода окрашивания геля для визуализации расположения белков в геле. Здравствуйте, я Шон Галлахер из компании UVP, работаю с Центром протеомики здесь, в Высшем институте KEG.

Сегодня я продемонстрирую вам ряд методов визуализации белков после разделения с помощью электрофореза. Сюда входят окрашивание кумасси синим, серебрение, а также окрашивание красителями cyro orange и cyro ruby. Итак, начнем с метода окрашивания кумасси синим.

Обнаружение белковых полос в геле с помощью окрашивания кумасси синим основано на неспецифическом связывании красителя. В данном случае используется кумасси бриллиантовый синий G-250. При этом белки, разделенные в полиакриламидном геле, промывают водой высокой степени очистки.

Затем локализация белков определяется с помощью окрашивания красителем кумасси синий на водной основе. Предел обнаружения составляет от 0,3 до 1 мкг на полосу белка. Для начала работы используйте полиакриламидный гель, в котором белки были разделены методом электрофореза.

При медленном перемешивании поместите полиакриламидный гель в пластиковый контейнер, наполненный 300 миллилитрами воды высокой степени очистки. Выдержите в течение пяти минут. Слейте воду и повторите процедуру еще дважды после третьей промывки.

Слейте воду и залейте гель окрашивающим раствором Coomassie blue на один час, обеспечивая медленное перемешивание. По истечении одного часа окрашивания слейте окрашивающий раствор. Кратковременно промойте гель, поместив его примерно в 200 миллилитров воды на 30 минут. На данном этапе гель можно хранить в воде для последующей визуализации.

На этом этапе гель также можно высушить для создания постоянного архива. Для этого поместите гель между двумя листами фильтровальной бумаги Whatman толщиной 3 мм и накройте сверху пластиковой пленкой. Затем высушите в обычном сушильнике для гелей в течение одного-двух часов при температуре около 80 °C.

Другим методом окрашивания белков является окрашивание серебром, которое мы продемонстрируем далее. Хотя метод окрашивания Coomassie blue проще и быстрее, окрашивание серебром значительно более чувствительно, с пределом обнаружения 0,3 нанограмма BSA. Обнаружение белковых полос в геле при окрашивании серебром зависит от связывания серебра с различными химическими группами белка.

Следующий протокол основан на использовании набора для окрашивания серебром Silver Quest от Invitrogen. Данный протокол представляет собой один из многих вариантов химических методов окрашивания серебром, совместимых с масс-спектрометрией, и основан на протоколе быстрого окрашивания, который занимает примерно 30 минут. В данном случае перед началом окрашивания серебром мы будем использовать готовый мини-гель от Invitrogen.

Обязательно используйте перчатки на протяжении всего процесса, чтобы избежать загрязнения отпечатками пальцев. Поместите гель в подходящий для микроволновой печи лоток с 100 миллилитрами воды квалификации «чистая для анализа». Кратковременно промойте гель, затем слейте воду.

Затем добавьте 100 миллилитров фиксатора, состоящего из 40% этанола и 10% уксусной кислоты в воде высокой степени очистки, и обработайте в микроволновой печи в течение 30 секунд. Микроволновой нагрев сокращает время необходимых этапов инкубации, ускоряя связывание и окрашивание. После этого поместите гель на шейкер и медленно встряхивайте в течение пяти минут.

Через пять минут слейте фиксатор, добавьте 100 мл 30% ethanol для промывки геля, обработайте в микроволновой печи в течение 30 секунд, а затем поместите гель на шейкер на пять минут. По истечении пяти минут слейте ethanol. Затем добавьте 100 мл сенсибилизирующего реагента, обработайте в микроволновой печи в течение 30 секунд и поместите на шейкер на две минуты.

По истечении двух минут слейте сенсибилизирующий реагент. Добавьте 100 миллилитров воды квалифицированной чистоты, прогрейте в микроволновой печи в течение 30 секунд и поместите на шейкер на две минуты. Слейте жидкость и повторите процедуру, чтобы в общей сложности провести два цикла промывки.

Теперь добавьте 100 milliliters окрашивающего раствора, прогрейте в микроволновой печи в течение 30 seconds и медленно перемешивайте в течение пяти минут. По истечении пяти минут слейте окрашивающий раствор. Добавьте 100 milliliters воды квалифицированного реактива, пропустив этап с микроволновой печью, и поместите образец непосредственно на шейкер на 20–60 seconds.

Слейте воду и немедленно добавьте 100 миллилитров проявителя; проявляйте до появления видимых белковых полос. При условии сохранения чистого фона это займет примерно от пяти до 10 минут. После этого добавьте в проявитель 10 миллилитров стоп-раствора, чтобы остановить процесс проявления для достижения наилучшего результата.

Сфотографируйте гель как можно скорее, так как возможны незначительные изменения интенсивности окраски и усиление неспецифического фонового сигнала. Со временем в геле, который вы видите, накапливаются остаточные белки. После электроблоттинга высушите гель для создания постоянного архива или храните его в герметичном пластиковом пакете. Далее мы продемонстрируем метод флуоресцентного окрашивания гелей.

Флуоресцентные красители обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными красителями для белков. Красители для белковых гелей Cipro orange, метод применения которых мы опишем ниже, позволяют обнаруживать от одного до двух нанограммов белка на полосу. Это более высокая чувствительность, чем при окрашивании Coomassie brilliant blue, и сопоставимая с чувствительностью многих методов окрашивания серебром.

Флуоресцентное окрашивание выполняется проще, требует меньше времени непосредственной работы, чем типичные протоколы окрашивания серебром, и завершается менее чем за один час. Окрашенные белки можно визуализировать с помощью стандартного УФ-транслюминатора с длиной волны 300 нанометров или лазерного сканера. В данном случае мы снова будем использовать готовый мини-гель Invitrogen для подготовки и разделения белков методом SDS-PAGE.

Однако в электрофорезе используйте буфер для разделения с содержанием 0,05% SDS вместо обычных 0,1% SDS, чтобы снизить фоновую флуоресценцию. Для начала процедуры окрашивания налейте флуоресцентный окрашивающий раствор cipro orange в небольшой пластиковый кювет для одного или двух стандартных мини-гелей. Используйте около 50 мл окрашивающего раствора.

Важно отметить, что емкости для окрашивания должны быть тщательно очищены и промыты перед использованием, так как любые моющие средства будут препятствовать окрашиванию. Теперь поместите гель в раствор для окрашивания. Накройте контейнер алюминиевой фольгой, чтобы защитить краситель от яркого света.

Осторожно перемешивайте гель при комнатной температуре от 40 до 60 минут. Слейте окрашивающий раствор, затем промойте гель в течение менее одной минуты 7,5% уксусной кислотой (около 100 миллилитров) для удаления избытка красителя с поверхности геля; задержите гель, инкубируя его в течение ночи в 0,1% Tween 20 для визуализации и фотографирования белковых полос. Поместите гель с флуоресцентной меткой непосредственно на стандартный 300-нанометровый транслюминатор или транслюминатор с синим светом.

Далее мы продемонстрируем альтернативный метод флуоресцентного окрашивания с использованием флуоресцентного красителя Cipro ruby. Метод окрашивания Cipro ruby был разработан специально для использования в двухмерном электрофорезе, однако он оказался наиболее чувствительным красителем для белков при стандартном одномерном SDS-PAGE. Для начала перенесите гель в чистый полипропиленовый или ПВХ-контейнер соответствующего размера.

Инкубируйте гель в соответствующем количестве неразбавленного красителя для белковых гелей cipro ruby при постоянном осторожном перемешивании на орбитальном шейкере при 50 об/мин. Накройте гель и инкубируйте не менее трех часов. Перенесите гель в чистую кювету для окрашивания, промойте его один раз в растворе 10% метанола и 7% уксусной кислоты, затем извлеките и снова поместите гель на рокер на 30 минут.

Чтобы снизить фоновую флуоресценцию и повысить чувствительность, гель теперь готов к просмотру и фотографированию. Благодарю вас за просмотр сегодняшних протоколов. Мы продемонстрировали вам ряд различных процедур визуализации белков после электрофореза.

Некоторые методы обладают высокой чувствительностью, например, флуоресцентное и серебрение, в то время как другие являются рутинными, как окрашивание по Камаси (Koomassie blue). Важно помнить, что чистота реагентов имеет решающее значение. Также крайне важно использовать ультрачистую воду и строго соблюдать временные интервалы на каждом из этапов.

Вам необходимо уделять этому пристальное внимание, чтобы также добиться воспроизводимых результатов. На этом всё, и желаем удачи в проведении вашего следующего цикла экспериментов.