Интервью: Биореакторы и поверхностью из-Modified 3D-Строительные леса для исследования стволовых клеток

Меня зовут Карлан, я работаю биофизиком в Институте биологических интерфейсов при Калифорнийском технологическом институте. Мы разрабатываем биореакторы и модифицированные по поверхности трехмерные скаффолды для культивирования функциональных тканей и исследований стволовых клеток; нас в первую очередь интересует взаимодействие клеток с их искусственной средой. В редакционной статье журнала Nature 2003 года был задан вопрос о том, что представляет собой «плоская биология», и вопрос заключался в следующем: что именно подразумевается под этим термином?

В прошлом многие системы культивирования in vitro, главным образом монослойные культуры, имели такие недостатки, как, например, относительно короткий срок жизни дифференцированных первичных клеток и их дедифференцировка в процессе культивирования. Это означало, что они очень быстро теряли большинство своих органоспецифических функций. Следовательно, с целью более точного воспроизведения условий среды для этих клеток in vitro, в традиционные монослойные культуры было внесено множество различных модификаций и адаптаций.

Это включает в себя состав питательной среды и создание покрытия культуральных сосудов, в которых клетки преимущественно образуют монослои. Все эти подходы указывают на важность взаимодействий между клетками и матриксом, а также на межклеточную коммуникацию. Другим важным аспектом представляется создание клеточно-специфического контекста, который реализуется, например, за счет щелевых соединительных комплексов, являющихся общей характеристикой многих клеток in vivo.

В традиционных монослойных культурах щелевая коммуникация быстро утрачивается. В течение долгого времени было возможно в определенной степени восстановить in vitro тканеподобное расположение клеток, используя так называемый стероидный метод.

В качестве примера из нашей лаборатории мы могли показать, что даже зрелые гепатоциты крыс способны синтезировать стероиды и оставаться жизнеспособными в таких агрегатах на протяжении как минимум нескольких недель. Гепатоциты остаются в тесном контакте друг с другом, что способствует межклеточной коммуникации, приводящей к стабилизации специфических функций гепатоцитов. Однако мы также обнаружили, что этот традиционный метод трехмерного культивирования имеет несколько недостатков.

Размер агрегатов имеет решающее значение. Большие диаметры агрегатов могут вызвать некроз, и в большинстве случаев соотношение объема среды к количеству клеток оказывается ненадлежащим. Кроме того, проблемы могут вызвать силы сдвига и использование спиннер-культур.

Органы и ткани живых организмов, помимо прочего, характеризуются очень высокой плотностью клеток; также важной характеристикой является направленный активный транспорт веществ через эти тканевые слои. Следовательно, реалистичные органотипические модели тканей in vitro должны максимально точно воспроизводить эту природную архитектуру. При этом определяющим фактором для ограничения таких систем является подходящее соотношение объема среды к объему клеток.

Как я упоминал ранее, мы разработали подходящий корпус для клеток в виде прецизионно микроструктурированного полимерного скаффолда, который представляет собой набор контейнеров одинакового размера для трехмерного культивирования клеточных агрегатов. В качестве материала для полимерного скаффолда мы предпочтительно используем ПММА или поликарбонат. Он состоит из микроструктурированного планарного устройства площадью один квадратный сантиметр, которое содержит плотный массив из более чем 1000 таких контейнеров.

Было показано, что данная система подходит для трехмерного культивирования клеточных агрегатов в течение нескольких недель. Каждый из этих малых кубических контейнеров в массиве имеет длину ребра около 300 Micrometers. Особая конструкция этого каркаса и периферии, а именно — инкубационной камеры.

Система подачи среды и газа ector позволяет использовать различные режимы подачи среды. Во-первых, суперфузия, при которой обе стороны ткани независимо снабжаются питательной средой, и, во-вторых, перфузия.

Это означает, что поток среды принудительно проходит сквозь слой ткани. Режим перфузии может использоваться для создания условий, которые лучше имитируют васкуляризацию in vivo, однако возможен и смешанный режим перфузии и суперфузии. Были разработаны различные поколения клеточных чипов.

Каждое поколение может быть использовано в определенной конфигурации для удовлетворения needs любого специального применения. Например, были созданы конструкции одно- и двухкамерных биореакторов, а также отдельно адресуемые многотитровые системы или высокопараллельные варианты. В качестве масштабированных версий последнего поколения этих различных форм были разработаны так называемые микротермоформованные контейнеры — определенная технология, которая предоставляет дополнительную возможность модифицировать всю поверхность этих 3D-контейнеров; при этом становится возможным даже создание поверхностного структурирования субмикронного масштаба с использованием сигнальных молекул.

Кроме того, могут быть интегрированы датчики и сигнальные электроды. Область применения варьируется от фундаментальных исследований и клеточной биологии до токсикологии и фармакологии, а также возможен высокопроизводительный скрининг. Очень важным моментом в заключение является тот факт, что последнее поколение наших микротермоформовочных чипов было оптимизировано для обеспечения процессов дешевого массового производства и, следовательно, для использования в других лабораториях.