Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Sea elegans является невероятно полезным модельным организмом благодаря как нашим знаниям о его клеточных линиях, так и огромному количеству информации, полученной в результате секвенирования и анализа всего его генома. В этом видео мы демонстрируем процесс микроинъекции плазмид в sea elegans и селекцию трансгенного потомства с помощью флуоресцентной микроскопии; поскольку sea elegans является прозрачным многоклеточным животным, он идеально подходит для визуализации трансгенов, экспрессирующих флуоресцентно меченые белки in vivo. Здравствуйте, меня зовут Лора Берковиц, я научный сотрудник лаборатории Колдвелла на факультете биологических наук здесь, в Университете Алабамы.

А я — Адам Найт, также из лаборатории Колвелла в Университете Алабамы. Сегодня я покажу вам, как подготовиться к микроинъекции плазмид и провести её для создания трансгенных *C. elegans*, а также расскажу, как отбирать и поддерживать линии трансгенных *C. elegans*. Итак, приступим.

Прежде чем приступить к микроинъекции, необходимо выполнить несколько подготовительных этапов, которые я сейчас продемонстрирую. Сначала подготовьте плазмидную ДНК для инъекции; потребуются две плазмиды: одна, кодирующая тканеспецифическую экспрессию нашего целевого гена, и вторая, содержащая селективный маркер трансформации. Смешайте плазмиды в соотношении один к одному, чтобы итоговая концентрация составляла 50 ng/µL.

Затем подготовьте специальные подложки, которые будут использоваться для иммобилизации червей перед инъекцией. Чтобы изготовить такие подложки, сначала разложите на рабочем столе несколько покровных стекол размером 22 × 50 мм. С помощью пастуральной пипетки нанесите каплю расплавленного 2% агарозы на одно покровное стекло и немедленно накройте каплю вторым покровным стеклом, расположив его под углом 90 градусов к первому.

Дайте аэрогелю затвердеть в течение нескольких секунд, после чего снимите верхнее покровное стекло. Диаметр сплющенного диска аэрогеля должен составлять от 15 до 20 миллиметров. Оставьте подушечку до полного высыхания на воздухе в течение нескольких часов или на ночь.

После высыхания храните планшеты в коробке для покровных стекол при комнатной температуре. Затем подготовьте иглы-загрузчики для раствора ДНК. Для этого возьмите капиллярную трубку объемом 100 µL, нагрейте её посередине в открытом пламени и резко вытяните примерно до удвоенной длины.

После охлаждения капиллярной трубки разломите ее пополам. Подготовьте запас из 10–20 игл-загрузчиков для инъекций. Их можно хранить вертикально в микроцентрифужной пробирке.

Брэк, будь осторожен. Острия загрузчика игл очень острые. Теперь изготовь иглы для микроинъекций.

Данные иглы изготовлены из специальной капиллярной трубки, содержащей внутреннюю стеклянную нить. Эта нить служит фитилем для раствора ДНК. Для изготовления игл используется вытяжной прибор Niki PP eight 30 Polar; при температурном режиме 24.8 за один раз вытягивается несколько игл для последующего хранения.

Несколько игл можно закрепить на полоске моделирующего пластилина. Для разлома кончика вытянутой иглы будут использоваться небольшие осколки покровного стекла. Эти осколки подготавливают, обернув покровное стекло размером 18 на 18 миллиметров салфеткой Kim wipe и осторожно нажимая на него до тех пор, пока оно не разобьется на несколько частей.

Используйте осколки размером примерно три на четыре миллиметра. Помимо подготовки ДНК и игл, подготовьте около 50–100 червей соответствующей стадии развития. Для каждого экспрессионного вектора, который будет введен, необходимо подготовить по две червя дикого типа.

Теперь мы готовы к настройке микроинъекционного микроскопа. Для начала настройки микроскопа откройте главный вентиль на баллоне с гелием, который подключен к манипулятору и держателю иглы для микроинъекций. Закройте регулятор, чтобы газ поступил в линию.

При давлении 35 PSI газ можно выпускать с помощью ножной педали. Затем вставьте загрузочное устройство для иглы в трубку стандартного автоматического дозатора и наберите небольшое количество смеси плазмид, примерно один микролитр. Теперь осторожно вставьте загрузочное устройство через иглу для микроинъекций до появления сопротивления.

Осторожно выдуйте раствор ДНК и извлеките загрузочное устройство. После загрузки ДНК вставьте иглу в рычаг микроинъектора, стараясь поместить ее внутрь небольшой внутренней резиновой прокладки, а затем закрепите ее зажимом на рычаге манипулятора. Затем поместите осколок покровного стекла для обломки иглы на один край подложки.

Покройте осколок, а также всю поверхность предметного стекла для навесного препарата, углеродным маслом. Затем поместите стекло на предметный столик инвертированного микроскопа. Когда стекло будет установлено, с помощью объектива Forex и освещения в светлом поле центрируйте иглу в поле зрения, но пока не опускайте ее в масло.

Затем расположите внутренний край осколка покровного стекла в центре и сфокусируйтесь на нем. Опустите иглу в масло, приведя ее в ту же фокальную плоскость, что и осколок покровного стекла. Увеличьте увеличение, переключившись на объектив 40 x, затем снова сфокусируйтесь на крае осколка и при необходимости измените положение кончика иглы.

Теперь разломите кончик инъекционной иглы. Осторожно прижмите иглу к краю осколка покровного стекла, одновременно подав короткий импульс газа с помощью ножной педали. После этого кончик иглы будет достаточно разломан.

Нежелательно, чтобы из конца иглы выходили мелкие капли жидкости из-за слишком большого потока, так как это приведет к гибели животных. После подготовки иглы мы приступаем к микроинъекции. Затем поднимите иглу вверх, чтобы снять подушечку с яйцами из-под объектива.

При этом не изменяйте положение по осям X или Y. Выдвиньте предметный столик из-под иглы. Снимите подложку со шнеком и поместите её под диссекционный микроскоп.

Перенесите червя на подушечку под слой масла. Если червь извивается, осторожно погладьте его, пока он не коснется поверхности подушечки; влажный червь должен прилипнуть к сухой поверхности. Быстро поместите подушечку обратно на предметный столик, центрируя червя в поле зрения.

Затем опустите иглу в ту же плоскость фокуса, в которой находится червь. Переключите фильтры на инвертированном микроскопе на освещение по Хоффману. Этот контрастный фильтр позволяет визуализировать морфологические детали червя.

Используя объектив 40x, сфокусируйтесь на зернистом сенсорном центре гонады червя, расположенном ниже сотового рисунка герминативных ядер. Выберите ту гонаду, которая находится со стороны иглы. Точно отрегулируйте положение иглы, пока ее кончик также не окажется в фокусе.

Осторожно введите иглу в центр гонады и подайте короткий импульс давления газа, чтобы вытеснить одну или две капли ДНК в плечо гонады. При наличии достаточного опыта и навыка вы должны наблюдать волну жидкости, распространяющуюся по дистальной части гонады. Вы сможете каждый раз попадать точно в центр гонады.

Помните, что при проведении инъекции червя важно работать быстро, так как он может легко пересохнуть. В идеале весь процесс должен занимать менее одной-двух минут.

После завершения инъекции снимите подложку с винтовым зажимом со столика и поместите ее под диссекционный микроскоп. Нанесите 1 µL буфера M9 непосредственно на инъецированного червя. Для этого может потребоваться погрузить кончик пипетки ниже поверхности галокарбового масла.

Буфер должен регидратировать червя, после чего он отделится от поверхности аэрозольной подушки; перенесите червя на обычный планшет с помощью зонда для червей. Теперь я передам инъецированных червей Адаму, и он продемонстрирует нам процесс селекции и поддержания трансгенных линий. Инъецированные черви переносятся на индивидуальные свежие чашки диаметром 60 мм с питательной средой, где им дают размножиться.

Эти черви представляют собой поколение P0. Обычно инъецированных животных инкубируют при 20 °C в течение двух-трех дней до появления потомства. После появления потомства можно приступать к скринингу трансгенных червей.

Потомство F1 наблюдают на наличие трансгенного маркера. В данном случае селективный маркер является флуоресцентным, поэтому скрининг можно проводить с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Каждое флуоресцентное животное-носитель F1 отдельно клонируют на новую чашку.

Введенная особь P0 может дать от одной до пяти флуоресцентных потомков среди всего поколения F1. Позвольте гермафродитам F1 размножаться при 20 °C в течение двух-трех дней до появления потомства. После того как поколение F2 будет готово, в нем также проводят поиск трансгенных животных. Животные F2, которые унаследовали и экспрессировали трансгенный маркер, считаются стабильной линией.

Каждую независимую стабильную линию следует поддерживать как отдельную линию червей; размножайте каждую линию, перенося несколько трансгенных животных на новую чашку в каждом поколении. Это необходимо выполнять с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Если селективный маркер является флуоресцентным, для контроля вариабельности числа копий гена создайте минимум три независимые стабильные линии для каждого введенного конструкта.

Мы только что продемонстрировали вам способ микроинъекции экспрессионных векторных конструкций, методы визуализации и отбора стабильных линий. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.