Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Здравствуйте, я Рэндалл Хоффман, аспирант лаборатории Сьюзан Лайнус на кафедре биологии в Массачусетском технологическом институте (MIT). Сегодня я познакомлю вас с методом полуденатурирующего детергентного агарозного гель-электрофореза, или SDD-AGE. В нашей лаборатории этот метод используется для скрининга прионов и других амилоидогенных белков.

Наш вариант определения возраста с помощью SDD прост, надежен и может быть масштабирован для любого количества образцов. Амилоиды обладают исключительной устойчивостью к денатурации с помощью SDS, что позволяет отделять их от других белков методом SDDH. Однако данные SDDH сами по себе не могут служить подтверждением того, что вещество является амилоидом.

Для этого потребуются другие методы. Исходя из этого, позвольте мне продемонстрировать. S-D-D-H-S-D-D-H можно выполнить с использованием стандартного оборудования для горизонтального электрофореза ДНК.

Сначала необходимо собрать лоток для отливки геля. Размер аппарата зависит от количества ваших образцов. Для большого количества образцов мы используем планшет размером 20 на 24 сантиметра и до четырех гребенки с 50 лунками.

Для приготовления геля вам понадобятся низко-EEO-агароза средней или высокой плотности, 1X TAE-буфер и 10% стоковый раствор SDS. Приготовьте 1,5% раствор агарозы в 1X TAE. Рекомендуется сделать гель максимально толстым, чтобы можно было внести больше образца и повысить эффективность детекции. Нагревайте смесь в микроволновой печи до полного растворения агарозы.

Быстро добавьте стоковый раствор XSDS 100 X к 0,1% и перемешайте круговыми движениями. Если на этом этапе часть агарозы затвердеет, растворите ее на плите. Будьте осторожны, чтобы раствор не закипел.

После добавления SDS раствор может легко вспениться, поэтому перелейте его в литейную форму, пока он еще горячий. Затем с помощью гребенки удалите все пузырьки воздуха, которые могут помешать в дальнейшем при переносе геля. После полного охлаждения и затвердевания геля осторожно извлеките гребенки и поместите гель в камеру.

Полностью погрузите гель в буфер 1X TAE с 0.1% SDS. Теперь можно приступать к нанесению образцов. Образцы белков для SDDH готовят так же, как и для SDS-PAGE, за двумя важными исключениями.

Во-первых, следует избегать нагрева образцов, который может привести к денатурации агрегатов в белковые мономеры. Во-вторых, примите меры для предотвращения деградации белка. Поскольку используемые здесь денатурирующие условия недостаточны для инактивации всех протеаз, мы рекомендуем использовать полную смесь ингибиторов протеаз в концентрации, как минимум в два раза превышающей рекомендуемую.

В данной демонстрации мы будем использовать лизаты клеток дрожжей, в которых сверхэкспрессирован определенный интересующий нас белок. Как правило, мы используем две мл ночных культур, выращенных в 96-луночных планшетах производства VWR, однако при анализе белков с низкой экспрессией необходимо использовать бóльшие объемы культур.

Соберите клетки, центрифугируя культуру при 2000 RCF в течение пяти минут при комнатной температуре; после центрифугирования удалите супернатант и промойте клетки, ресуспендировав их в воде и повторно центрифугировав. После второго осаждения удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в соответствующем растворе для посева. Ферменты в растворе переваривают клеточные стенки, что позволит эффективно лизировать клетки с использованием небольшого объема лизирующего буфера. Инкубируйте в течение 30 минут при 30 °C.

На этот раз осадите оставшиеся пластиковые кюветы при 800 RCF в течение пяти минут. Полностью удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в 100 µL лизирующего буфера. Затем заклейте блок лентой и перемешайте на вортексе на высокой скорости в течение двух минут.

Это позволяет осадить весь клеточный дебрис в пластиковых пробирках при 4 000 RCF в течение двух минут. Осторожно перенесите супернатант в 96-луночный ПЦР-планшет.

Как правило, в нашей лаборатории мы анализируем сотни образцов одновременно, поэтому для помощи в этом процессе используется система автоматического дозирования жидкостей. При необходимости определите концентрацию белка в лизатах. Затем добавьте к образцам 4x буфер для образцов, чтобы получить лизаты с концентрацией буфера 1x, и инкубируйте их в течение пяти минут при комнатной температуре.

Теперь внесите образцы в гель. При необходимости сохраните половину образцов для анализа методом SDS-PAGE. Также внесите маркеры молекулярной массы, включая предварительно окрашенные маркеры и маркер с очень высокой молекулярной массой, такой как экстракт флектора курицы.

При необходимости важно поддерживать гель в охлажденном состоянии, чтобы предотвратить диффузию низкомолекулярных белков, поэтому электрофорез рекомендуется проводить в холодильной комнате. Проводите электрофорез при низком напряжении — менее трех вольт на сантиметр длины геля. Продолжайте разделение в течение нескольких часов, пока краситель не достигнет расстояния примерно одного сантиметра от края геля.

Поскольку амилоиды не денатурируют 2% SDS при комнатной температуре, они сохраняют целостность, в то время как другие комплексы, включая большинство неамилоидных агрегатов, диссоциируют в присутствии 2% SDS. Таким образом, большинство белков будут находиться в мономерной форме и быстро пройдут через гель, тогда как устойчивые к SDS высокомолекулярные амилоиды будут мигрировать медленнее.

После этого гель будет готов к переносу. Хотя можно использовать несколько методов переноса, наилучшие результаты мы получаем при капиллярном переносе. Поскольку капиллярный перенос позволяет работать с гелями любого размера, он удобен для анализа сотен образцов.

Стопка сухих фильтровальных бумаг служит для вытягивания буфера через гель, в результате чего белки осаждаются на нитроцеллюлозную мембрану, помещенную между бумагой и гелем. Вам потребуется вырезать кусок нитроцеллюлозы, например High Bond C, Extra, того же размера, что и гель. Также вам потребуется вырезать 20 листков фильтровальной бумаги GB 04 и 8 листков фильтровальной бумаги GB 02 того же размера, что и гель.

GB 04 очень плотный и обладает высокой впитывающей способностью. В то время как GB 02 гораздо тоньше и имеет более мелкозернистую текстуру, что обеспечивает более равномерный контакт с мембраной. Вырежьте дополнительный фрагмент GB 04 для использования в качестве фитиля; он должен быть примерно на 20 сантиметров шире, чем погруженный гель.

Поместите в пластиковый контейнер нитрозный UL WIC, четыре пластины GBO O₂ и одну XTBS. Соберите стопку из фильтров следующим образом: 20 пластин сухого GBO O₄, затем четыре пластины сухого GBO O₂ и одну предварительно увлажненную пластину GBO O₂.

Положите нитроцеллюлозную мембрану поверх этого стека. Кратковременно промойте гель на литьевой форме водой, чтобы удалить излишки бегающего буфера. Затем осторожно начните перемещать гель с формы на стек, при необходимости смачивая мембрану раствором TBS в процессе соскальзывания геля с формы.

Дополнительный буфер помогает предотвратить попадание пузырьков воздуха в гель. Для этой цели, после полного перемещения геля в стек, удобно использовать трансфер-пипетку. Тщательно проверьте наличие пузырьков воздуха, если они появились.

Приподнимите край геля и снова нанесите буфер, пока не удастся вытеснить пузырьки воздуха. Положите оставшиеся три предварительно увлажненных фрагмента GBO на поверхность геля. Обеспечьте плотный контакт между всеми слоями, осторожно прокатив пипетку по поверхности стопки.

Поместите стопку для переноса между двумя приподнятыми лотками, содержащими TBS; накройте стопку предварительно смоченным фитилем так, чтобы оба его конца были погружены в раствор. Накройте собранную стопку для переноса дополнительным пластиковым лотком, создав дополнительный вес, например, с помощью бутылки с водой объемом 500 мл. Фитиль будет вытягивать буфер из лотков, а сухие фильтровальные бумаги будут протягивать буфер через гель в течение нескольких часов.

Это позволит осадить белки на мембране; дайте переносу протекать в течение минимум трех часов или в течение ночи. После завершения капиллярного переноса мембрану можно обработать стандартным методом вестерн-блоттинга. Здесь представлен типичный блот белков, которые были сверхэкспрессированы в штамме дрожжей, предрасполагающем определенные белки к формированию амилоидов.

Четко видно, что некоторые из наших кандидатов очень хорошо образуют амилоиды или высокомолекулярные SDS-резистентные формы, как показано здесь и здесь. Другие же не образуют агрегатов и остаются полностью мономерными, как в этих и этих случаях. Кроме того, видно, что размер амилоидных полимеров различается в зависимости от белка, что заметно в этих двух дорожках.

Мы только что продемонстрировали вам простой метод анализа высокомолекулярных нерастворимых агрегатов, таких как амилоиды белков-кандидатов в прионы. Надеемся, что наш видеоматериал был вам полезен и эта методика окажется применимой в исследованиях иммуногенных амилоидных белков. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших исследованияниях.