Метилированный Иммунопреципитация ДНК

В данном видео демонстрируется протокол иммунопреципитации метилированной ДНК, или метод MeDIP. Этот метод используется для специфического и непредвзятого выделения метилированной ДНК. Метилирование ДНК у млекопитающих характеризуется присоединением метильной группы к пятому положению цитозина.

При наличии в CpG-динуклеотиде метилирование представляет собой обратимую эпигенетическую метку, которая играет важную роль как в нормальном развитии, так и в развитии ряда заболеваний. Нормальные функции метилирования ДНК включают инактивацию X-хромосомы у самок, сайленсинг повторяющихся элементов, геномный импринтинг и поддержание стабильности генома. Также было показано, что метилирование ДНК играет роль при множестве заболеваний, таких как рак, синдром де Вилли, синдром Энгельмана, иммунодефицит, синдром центромерной нестабильности и лицевых аномалий.

При онкологических заболеваниях, например, аномальный гиперметилирование промоторов может привести к сайленсингу жизненно важных генов-супрессоров опухолей. В то же время неправильное гипометилирование приводит к хромосомной нестабильности и активации онкогенов. Процедура выполняется путем предварительной соникации ДНК на фрагменты размером от 300 до 1000 пар оснований. Затем соникатированная ДНК подвергается денатурации при 95 °C.

Добавляют первичные антитела, распознающие 5-метилцитозин, и выдерживают их для связывания с метилированными фрагментами ДНК. Для выделения фрагментов ДНК, связавшихся с первичными антителами, используют вторичные антитела, конъюгированные с магнитными дина-бидами. Неметилированные фрагменты удаляют, а антитела подвергают расщеплению протеиназой.

Очистка смесью фенола и хлороформа удаляет переваренный белок, а осаждение очищает ДНК, которая теперь обогащена метилированными фрагментами. Полученная ДНК может быть использована для таких приложений, как ПЦР-микрочипы и секвенирование. Данная процедура обычно проводится в течение двух дней.

Первый день включает подготовку ДНК, соникацию, иммунопреципитацию и расщепление белков. Второй день включает экстракцию хлороформом при определенном pH и осаждение этанолом для очистки и выделения ДНК, обогащенной метилированием. Для проведения процедуры требуются некоторые специальные материалы, включая силиконизированные центрифужные пробирки, устройство для соникации ДНК, первичные антитела (мышиные моноклональные антитела к 5-метилцитозину), вторичные антитела (Dynabeads, конъюгированные с анти-человеческими IgG из овцы) и магнитный штатив для пробирок.

Первым этапом протокола The meetup является подготовка ДНК. Крайне важно предварительно оценить природу ДНК. Необходимо знать состояние образца ДНК — является ли он преимущественно двухцепочечным или одноцепочечным, поскольку точное количественное определение образца имеет первостепенное значение, а на различные методы определения количества ДНК может негативно влиять присутствие нежелательных форм ДНК.

Количество двухцепочечной ДНК можно легко определить методом спектральной фотометрии с помощью NanoDrop 3, 300; нанесите 1,5 µL и установите тип измерения «nucleic acid», выберите «DNA 50» для расчета и инициализируйте прибор, используя 1,5 µL воды. Очистите пьезоэлектрические платформы и обнулите прибор, нанеся 1,5 µL жидкости. Образец растворен в [чистой воде]; очистите платформы, нанесите 1,5 µL образца и нажмите кнопку измерения.

Концентрация будет указана и может быть использована. Для расчета необходимого количества микролитров следует использовать соотношение A260/A280; в данном случае идеальным является значение 1,8. Готовится образец с массой 1 µg.

Тем не менее, для получения успешных результатов достаточно образца массой всего 200 nanograms. Для этого перенесите образец ДНК в чистую силиконизированную пробирку. Добавьте достаточное количество стерильной воды, чтобы довести конечный объем до 50 microliters.

Соникацию ДНК и иммунопреципитацию необходимо проводить в силиконизированных пробирках, чтобы предотвратить неспецифическое связывание ДНК и белков со стенками пробирок. После подготовки ДНК образец необходимо подвергнуть соникации, так как фрагментация ДНК повышает эффективность иммунопреципитации, при которой лучше работают более короткие фрагменты ДНК. Поместите образец в соникатор, установите высокую мощность и время работы 30 секунд. В режиме 30 секунд работы и 30 секунд отдыха заполните основание до отмеки водой при температуре 4 °C.

Обработайте образец ультразвуком в течение семи минут. По завершении соникации извлеките пробирку и поместите ее на лед. Важно заранее оптимизировать условия соникации в соответствии с ожидаемым типом вашего образца и размером DNA.

Например, частично деградированный образец ДНК потребует меньшего времени соникации. Продукты соникации можно визуализировать с помощью стандартных методов электрофореза. На данном этапе для последующего использования требуются фрагменты ДНК длиной от 300 до 1000 пар оснований.

При проведении микроматричного анализа и ПЦР следует оставить одну пятую часть вашей ДНК в качестве входной или референсной ДНК; в данном случае 800 nanograms соникатированной ДНК будут использованы для иммунопреципитации, а остальное будет отложено как референсная ДНК. Следующим этапом протокола является иммунопреципитация или реакция IP; перед добавлением первичного антитела ДНК необходимо денатурировать. Денатурация необходима, поскольку первичное антитело чувствительно к одноцепочечной ДНК.

Поместите образец в водяную баню при 95 °C на 10 минут. По завершении этапа денатурации немедленно перенесите пробирку на лед минимум на пять минут. Это предотвратит ренатурацию денатурированной ДНК и обеспечит оптимальное связывание антител после охлаждения образца.

Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы осадить содержимое на дно. Затем следует добавить первичный антитело. Количество используемого антитела должно быть титровано для каждой партии и для каждого производителя.

В данном случае мы добавляем 5 µg первичных антител, затем добавляем буфер для иммунопреципитации или IP-буфер до конечного объема 500 µL. Затем IP-ДНК помещают в ротатор и инкубируют при температуре 4 °C в течение двух часов. Ротация необходима для предотвращения агрегации антител в пробирке во время инкубации.

Примерно за 15 минут до завершения инкубации с первичными антителами очистите и подготовьте магнитные частицы DynaBeads. Сначала тщательно ресуспендируйте частицы в флаконе с помощью вортекса. Затем перенесите 30 µL частиц в чистую силиконизированную пробирку и поместите эту пробирку на магнитный штатив для проведения нескольких реакций.

Перенесите 30 мкл бусин на одну реакцию, добавив объем для одной дополнительной реакции, чтобы компенсировать возможные ошибки при пипетировании или случайную потерю части бусин. Например, для восьми реакций перенесите количество бусин для девяти реакций, что составляет 270 мкл.

Магнитные частицы притянутся к стенке магнитного штатива. Подождите две минуты, пока частицы переместятся и соберутся в четкую полосу на стенке пробирки. Затем аккуратно удалите и утилизируйте супернатант с помощью пипетки, стараясь не задеть кончиком наконечника частицы на задней стенке.

Замените супернатант избыточным объемом буфера для иммунопреципитации, перемешайте на вортексе и снова поместите на магнитный сепаратор на две минуты. Повторите эту промывку еще один раз, затем ресуспендируйте бусины в исходном объеме буфера для иммунопреципитации. Извлеките пробирку с образцом из ротатора по завершении инкубации.

Для завершения иммунопреципитации добавьте 30 µL чистых магнитных частиц в реакционную смесь и поместите пробирку обратно в ротатор на два часа при температуре 4 °C. В ходе этой инкубации вторичные антитела (анти-мышиные IgG) свяжутся с первичными мышиными антителами. Анти-мышиные антитела конъюгированы с магнитными частицами Dynabeads, что позволяет легко извлечь связавшиеся продукты и провести последующий этап очистки.

После завершения инкубации с обоими антителами поместите пробирку для иммунопреципитации (IP) на магнитную подставку на две минуты. К этому моменту метилированная ДНК будет связана первичным антителом, которое, в свою очередь, будет связано вторичным антителом, конъюгированным с магнитными частицами DynaBeads. Удалите и утилизируйте супернатант, заменив его 500 µL буфера для IP.

Перемешайте содержимое пробирки и поместите ее обратно в штатив на две минуты. Повторите эту промывку буфером для IP еще один раз. После удаления супернатанта после последней промывки Resus в последний раз ресуспендируйте гранулы.

В 400 µL буфера для переваривания обработайте реакционную смесь 100 µg протеиназы K и инкубируйте в течение ночи при 50 °C. Обработка протеиназой K необходима для переваривания белков антител и любых остаточных белков, связанных с ДНК, что позволяет метилированной ДНК высвободиться в раствор. Очистка ДНК проводится на второй день процедуры; извлеките пробирку с перевариваемым образцом из инкубатора.

В вытяжном шкафу добавьте в пробирку 500 µL фенол-хлороформа в соотношении 1:1 при pH 7 и тщательно перемешайте на вортексе. Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут при 13 000 ×g. Осторожно удалите верхнюю водную фазу из пробирки, не затрагивая интерфазу и не удаляя органический слой. Перенесите водную фазу в новую пробирку.

Если граница раздела фаз выглядит мутной, можно провести повторную экстракцию. Затем добавьте 1/10 объема трехмолярного ацетата натрия, в данном случае 40 µL. В качестве носителя для облегчения очистки осадка можно использовать 1 µL гликогена.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе. Затем добавьте два объема 100% ethanol, снова перемешайте на вортексе и выдержите в морозильной камере при температуре -20 °C в течение 20 минут. После замораживания осажденную ДНК центрифугируют при 13 000 G и 4 °C в течение 20 минут.

На дне пробирки образуется осадок ДНК. Извлеките пробирку из центрифуги и удалите этанол. Будьте осторожны, чтобы не повредить осадок на дне пробирки.

Для удаления остатков этанола может потребоваться короткое центрифугирование (pulse spin). Для промывки осадка добавьте 500 µL холодного 70% этанола, перемешайте на вортексе и снова центрифугируйте в течение 20 минут при 13 000 G и 4 °C. После завершения второго этапа центрифугирования удалите 70% этанол коротким центрифугированием, а затем удалите остатки этанола с помощью пипетки.

Оставьте пробирку в штативе с открытой крышкой, чтобы осадок просох, а остатки этанола испарились. Наконец, ресуспендируйте осадок, содержащий только обогащенную метилированием ДНК, в 10 µL стерильной воды, предоставив достаточно времени для полного растворения осадка ДНК перед использованием. Рекомендуется проверить эффективность выделения с помощью ПЦР.

Это можно осуществить путем проведения реакций ПЦР, разработанных для амплификации продуктов, которые дифференциально демонстрируют метилированные и неметилированные фрагменты ДНК с использованием праймеров, амплифицирующих нормальную ДНК человека. Контрольный регион импринтинга H 19 может быть использован совместно с праймерами, предназначенными для амплификации неметилированного участка генома. Примеры последовательностей праймеров и условий циклов ПЦР приведены в прилагаемом протоколе.

На данном этапе необходимо использовать исходную или референсную ДНК, отложенную в начале протокола «встречи» (meetup). Один набор ПЦР-реакций будет поставлен с использованием исходной ДНК, а другой — с использованием ДНК после иммунопреципитации (IP), обогащенной по метилированию. Если «встреча» прошла успешно, ПЦР после IP даст продукт при использовании праймеров на метилирование и не даст продукта при использовании контрольных праймеров.

Напротив, входная ПЦР должна давать продукты с использованием обоих праймеров, так как она содержит как метилированные, так и неметилированные фрагменты ДНК. ДНК, обогащенная метилированными фрагментами, может быть использована для ряда последующих приложений, таких как секвенирование ПЦР и микрочиповый анализ.

При интеграции с другими методами молекулярной биологии этот подход может быть использован для исследования статуса метилирования ДНК локально или в масштабе всего генома для профилирования метилирования или изучения эпигеномики.