Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители

Меня зовут Мария, я работаю в Y Healthcare в NOS, Швеция. Белки клеточной поверхности часто участвуют в коммуникации между клетками и окружающей средой, поэтому они представляют особый интерес для исследований, направленных на более глубокое изучение заболеваний, а также других биологических вариаций, вызванных изменениями в клеточном окружении. В этом видео я продемонстрирую простой протокол маркировки белков клеточной поверхности методом side-eye dodge, который позволит вам визуально обогатить эти низкокопийные белки без физического усиления и изучить различия этих белков клеточной поверхности с помощью данной технологии.

Если эта технология кажется вам интересной, вы можете найти дополнительную информацию в руководстве по 2D. Кроме того, у нас есть приложение по данной конкретной теме, которое можно скачать с сайта job. В представленном выше протоколе маркировки поверхности клеток окрашивание проводится, пока клетки остаются целыми. В процессе маркировки краситель будет иметь доступ только к белкам поверхности клеток.

После этапа мечения проводится анализ клеток для подтверждения специфичности мечения поверхности клеток. Образец с меткой разделяли на фракции мембранных и цитозольных белков. Параллельно готовили нефракционированный образец.

Для сравнения данный анализ фракционирования не является обязательным, но был проведен здесь лишь для того, чтобы показать, что протокол маркировки поверхности клеток специфичен именно для белков клеточной поверхности. Мы также выполнили стандартный протокол маркировки ETH без диеты, описанный ниже; в этом случае клетки лизируют перед маркировкой, и таким образом все клеточные белки становятся доступными для маркировки. После этапа маркировки образцы подвергают 2D-электрофорезу.

Адгезивные клетки отделяют с использованием неферментативного метода, чтобы избежать расщепления целевых белков клеточной поверхности. В данном протоколе мы используем резиновый скребок (полицеймен), однако в качестве альтернативы можно использовать среду для диссоциации клеток Enzyme Three; затем подсчитывают количество клеток и разделяют клеточные суспензии на аликвоты по 5–10 миллионов клеток в пробирку. После этого клетки осаждают центрифугированием и промывают в HPSS pH 7.4 для удаления следов среды для культивирования.

Загрязнение среды белками сыворотки и флуоресцентными компонентами может препятствовать маркировке и детекции. Клетки, растущие в суспензии, осаждают центрифугированием и промывают непосредственно перед этапом маркировки после промывки. Осадок клеток ресуспендируют в 200 µL ледяного буфера для маркировки, содержащего HEPES pH 8,5 и 1 M мочевины.

Для обеспечения оптимальных условий маркировки белков клеточной поверхности всегда проверяйте pH. Перед маркировкой мы использовали 600 пмоль Side-Eye на 10 миллионов клеток CHO. Оптимальное соотношение Side-Eye к количеству клеток будет варьироваться в зависимости от типа клеток.

Поскольку точные концентрации белков на поверхности клеток неизвестны, способ определения оптимальных условий для маркировки белков с помощью side-eye описан в руководстве по принципам и методам 2D-электрофореза. Клетки инкубируют с side eye D floor, minimal dice в течение 20 минут на льду в темноте.

После реакции мечения не вступивший в реакцию краситель гасят, добавляя 20 µL 10 мМ лизина. Затем меченые клетки дважды промывают в холодном буфере HPSS pH 7.4 для удаления избытка красителя. Таким образом, свободный краситель не останется для нежелательного внутриклеточного мечения или взаимодействия с белками на следующем этапе, которым является лизис клеток.

Белки на поверхности клеток теперь помечены, клетки промыты и готовы к лизису. Осадок, полученный после последнего этапа промывки, ресуспендируют в 150 µL холодного буфера для лизиса, содержащего 7 M мочевины, 2 M тиомочевины, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM ацетата магния (pH 8.5), и выдерживают на льду не менее одного часа, периодически перемешивая на вортексе. Теперь образцы готовы к 2D-разделению.

Первым этапом электрофореза является подготовка полосок IPD к регидратации. Приготовьте раствор для регидратации, добавив буфер IPG, соответствующий диапазону pH используемых полосок, и залейте раствор в лунки лотка для регидратации. Снимите защитную пленку с полоски IPG и аккуратно поместите полоски сухим гелем вниз в лоток для регидратации, содержащий раствор для регидратации.

Закройте крышку кассеты IPG и оставьте полоски для регидратации на ночь. В первом измерении, изоэлектрическом фокусировании, белки разделяются в соответствии с их pI. Эта процедура выполняется с использованием системы IPG four three.

Регидратированные полоски помещают в манифольд, сверху устанавливают электрод. С помощью колпачков для нанесения образцов наносят по 50 micrograms каждого образца. Мы использовали либо нефракционированные образцы, наносимые напрямую, либо образцы, предварительно разделенные на мембранные и цитозольные фракции.

Свинцовая заслонка закрыта для защиты флуоресцентных образцов от света. Прибор был запрограммирован в соответствии с рекомендациями, и запуск был осуществлен на ночь. Большие 12%-ные гели lamby были приготовлены с использованием взрослого 12-го геля.

Для предотвращения полимеризации акриловых гелей в трубках добавляли раствор Костера. Гелям давали полимеризоваться в течение ночи при комнатной температуре перед использованием. После изоэлектрического фокусирования полоски извлекали и уравновешивали в буфере, содержащем SDS, в два этапа: сначала использовали DTT для восстановления дисульфидных связей остатков цистеина, затем проводили алкилирование иодацетамидом, чтобы избежать модификации акриламидом.

Полоски IPG погружают в бегающий буфер и осторожно помещают на поверхность больших двумерных гелей. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха между полосками и гелем, сверху заливают расплавленным 2% раствором агарозы с бромфеноловым синим. Теперь гели готовы к разделению в режиме SDS-PAGE во втором измерении. В SDS-PAGE второго измерения.

Белки будут разделены по молекулярной массе с помощью системы tonal six. Заполните камеру для электрофореза анодным рабочим буфером, вставьте гели и заполните верхний отсек катодным рабочим буфером. Настройте блок питания согласно рекомендациям и проведите второе измерение в защищенном от света месте в течение примерно четырех-пяти часов или до тех пор, пока фронт красителя не достигнет нижней части геля.

После электрофореза во втором измерении гелевые кассеты с помощью захватов помещают в флуоресцентный сканер Typhoon. Одновременно можно сканировать два геля в трех каналах. Результаты этого двухмерного электрофореза (2D-ЭФ) демонстрируют высокое разрешение мембранных белков в образце, несмотря на некоторые известные ограничения при детектировании гидрофобных белков в 2D-ЭФ. Результаты показывают множество новых пятен меток поверхности клеток, отмеченных здесь красным, которые не обнаруживаются при использовании стандартного протокола мечения, отмеченного здесь зеленым.

Эти результаты показывают, что протокол маркировки поверхности клеток обладает высокой специфичностью к белкам клеточной поверхности. Поскольку маркируются исключительно белки поверхности клеток, их легче визуализировать, и удается избежать затухания сигнала из-за обилия цитозольных белков. В верхней части представлено флуоресцентное изображение гелей с нефракционированной мембранной фракцией или цитозольной фракцией.

Ниже представлено изображение того же геля после окрашивания серебром. Результаты показывают отсутствие флуоресцентного мечения цитозольных белков, однако окрашивание серебром подтверждает наличие белков в гелях. Результаты также демонстрируют схожие картины расположения пятен для нефракционированного образца и мембранных фракций, что доказывает отсутствие необходимости в фракционировании перед двумерным электрофорезом, благодаря чему данный протокол является простым и удобным.

SI two, SI three и SCI five демонстрируют схожие паттерны мечения и полностью совместимы с протоколом анализа поверхности клеток. Был проведен эксперимент с диетой с использованием всех трех side eye DI floor minimal dy для изучения дифференциальной экспрессии белков поверхности клеток в клетках CHO при сывороточном голодании различной продолжительности. Образцы поверхности клеток CY two из всех образцов в эксперименте были объединены и использованы в качестве внутреннего стандарта.

В период голодания можно было проследить за дифференциальными изменениями нескольких белков клеточной поверхности. С помощью протокола для белков клеточной поверхности было обнаружено более 18 новых мембранных белков, которые не выявлялись при использовании стандартного протокола идентификации белков в препаративном геле. Для облегчения сопоставления с пятнами в аналитическом наборе данных потребовалось внесение внутреннего стандарта (спайкинг) в образец белков клеточной поверхности.

Результаты. Результаты демонстрируют высокое разрешение для большого количества белков клеточной поверхности. Данный протокол является очень специфичным для белков клеточной поверхности, и маркировки внутриклеточных белков не наблюдалось.

С помощью данного метода вы сможете обнаружить больше белков клеточной поверхности по сравнению со стандартным протоколом, и, как вы уже видели, этот протокол очень прост в исполнении. Вы просто маркируете белки клеточной поверхности, пока они еще не повреждены, и вводите их непосредственно в 2D-электрофорез без фракционирования мембран. Таким образом, этот протокол отлично подходит для изучения белков клеточной поверхности и их различий с помощью технологии D.