Техника для последовательного Коллекция спинномозговой жидкости из Cisterna Magna в мышь

Процедура начинается с анестезии мыши и подготовки операционного поля. Затем мышь помещают в прон-позицию в стереотаксический инструмент. Ниже затылочной области делают сагиттальный разрез кожи, после чего подкожную клетчатку и мышцы шеи тупым способом разделяют по срединной линии.

Затем заднюю часть тела укладывают таким образом, чтобы тело образовывало угол 135 градусов с зафиксированной головой; с помощью стеклянного капилляра прокалывают твердую оболочку в области большого затышечного отверстия (cisterna magna) и собирают ЦСЖ. После забора ЦСЖ мышцы возвращают на место и накладывают швы на кожу, подкожно вводят около одного миллилитра 0,9% раствора NACL для предотвращения обезвоживания, а мышь содержат в тепле до полного восстановления. Здравствуйте, меня зовут Лю, я из лаборатории доктора Карен Дафф в Институте Топ Колумбийского университета.

Сегодня я покажу вам, как осуществлять забор спинномозговой жидкости из цистерны magna мыши. С помощью этого метода мы можем проводить серийный забор проб СМЖ до трех раз у одной и той же мыши с интервалом в два-три месяца. В нашей лаборатории этот метод используется для определения уровней бета-амилоида или тау-белка в СМЖ в разные периоды жизни наших трансгенных моделей болезни Альцгеймера, после чего мы сопоставляем эти значения с данными, полученными из тканей мозга.

В итоге нас интересует потенциал уровней бета-амилоида или тау-белка в ЦСЖ в качестве возможных биологических маркеров прогрессирования заболевания, а также для проведения терапевтических испытаний на мышах. Итак, приступим. Для данной процедуры необходимо изготовить капилляры с помощью микропипетки.

Здесь используются капилляры из силикатного стекла BOA B 175 10 от компании Sutter Instruments. Вытягивание капилляров проводят на микропипеточном вытягивателе Sutter P 87 с индексом нагрева 300 и индексом давления 30. Стеклянный капилляр имеет длину 5 см и конический кончик. Кончик капилляра обрезают ножницами так, чтобы его внутренний диаметр составлял примерно 0,5 мм.

Хирургическая процедура начинается с анестезии мыши кетамином в дозе 100 milligrams per kilogram и ксилазином в дозе 10 milligrams per kilogram, вводимых внутрибрюшинно; во время анестезии мышь следует поддерживать в нагретом состоянии в инкубаторе при температуре 37 degree Celsius. После подтверждения полной анестезии животного с помощью теста на рефлекс отдергивания лапы при сжатии пальца, выбрейте шерсть на шее, затем поместите мышь в стереотаксический прибор, например, такой, как этот от David kink. В непосредственный контакт с нагревательной подушкой введите ректальный температурный зонд, чтобы можно было регулировать нагрев подушки в соответствии с температурой тела мыши.

Зафиксируйте голову с помощью головных адаптеров, трижды протрите кожу шеи 10% раствором повидон-йода и 70% этанолом, затем сделайте сагиттальный разрез ниже задней части головы или затылка. Следующие этапы следует выполнять под диссекционным микроскопом, используя тупые пинцеты. Отделите подкожную клетчатку и мышцы M by ventor services и M rectus capita dorsalis major так, чтобы обнажилась твердая мозговая оболочка sternum magna. Используйте пару микроретракторов для разведения мышц.

Наконец, положите мышь так, чтобы голова была под углом 135 градусов к телу. Теперь мышь готова к забору ЦСЖ. Данный метод забора ЦСЖ из большой цистерны была описан в предыдущих публикациях.

Рисунок 1 A под диссекционным микроскопом. Твердая мозговая оболочка выглядит как блестящий и прозрачный перевернутый треугольник, сквозь который видны продолговатый мозг и крупный кровеносный сосуд. Arteria dural spinella, рисунок 1 B. Видна циркуляторная пульсация продолговатого мозга и прилежащего субарахноидального пространства.

Промокните твердую мозговую оболочку стерильным ватным тампоном, введите капилляр в cisterna magna через твердую мозговую оболочку латеральнее arteria dorsalis spinalis. При правильном введении капилляра будет заметно изменение сопротивления, после чего спинномозговая жидкость начнет поступать в капилляр. После сбора спинномозговой жидкости осторожно извлеките капилляр и соедините его с трехмиллилитровым шприцем с помощью полиэтиленовой трубки с внутренним диаметром 1 mm.

Перенесите ЦСЖ в пробирку объемом 0.5 мл. Маркируйте пробирку и немедленно заморозьте ее на сухом льду. После замораживания перенесите ЦСЖ в морозильную камеру при температуре -80 °C.

Продемонстрированный метод отбора проб является крайне щадящим и позволяет брать последующие образцы ЦСЖ у одной и той же мыши с интервалом в два-три месяца. Таким образом, после забора проб мышцы и кожу в области шеи следует выровнять и закрыть швами. После наложения швов на разрез подкожно введите около 1 мл физиологического раствора 0.9%NACL для регидратации мыши.

Поддерживайте температуру тела мыши на уровне около 37 °C до ее полного восстановления. Контролируйте массу тела животного на первый и седьмой дни после операции. Я только что продемонстрировал вам способ забора спинномозговой жидкости из системного магнетического катетера мыши.

При выполнении данной процедуры следует помнить о трех важных моментах. Во-первых, правильно расположите голову и тело мыши на стереотаксической раме, чтобы максимально открыть доступ к области Cy Magna. Во-вторых, при проколе дурометрии капилляром будьте осторожны, чтобы не повредить кровеносные сосуды.

В противном случае ваш образец будет загрязнен кровью. И последнее, но не менее важное: пожалуйста, не забывайте поддерживать тепло животных на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить гипотермию. Гипотермия не только вредна для мышей, но и может существенно повлиять на ваши результаты, индуцируя продукцию бета-казеина или вызывая снижение фосфорилирования.

На этом все. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.