Yöntem makalesi

Hirschsprung Hastalığı Hastalarından Gangliyonik ve Agangliyonik Kolonik Segmentlerin Profillenmesi İçin Tek Hücreli RNA Dizilemesi

DOI:

10.3791/69825

⸱

22 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Hirschsprung hastalığında gangliyonik ve agangliyonik kolonik segmentler arasındaki bağışıklık hücre infiltrasyonunu ve hücre tipine özgü transkripsiyon farklarını analiz etmek için tek hücreli RNA dizileme iş akışını tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hirschsprung hastalığı (HSCR), distal bağırsakta enterik nöronların yokluğuyla karakterize edilen doğuştan bir bağırsak motilite bozukluğudur. Toplu RNA dizileme ile karşılaştırıldığında, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), tek hücre seviyesinde gen ifade profilini sağlar ve popülasyon ortalamalı analizlerde gizlenen hücresel heterojenliği çözer. HSCR hastalarından gangliyonik ve agangliyonik segmentlerin transkripsiyon ortamını karakterize etmek için standartlaştırılmış bir scRNA-seq iş akışı oluşturuldu. Kolon dokuları toplandı ve gangliyonik ve agangliyonik bölgeler tanımlanmak için hematoksilin ve eozin boyama yapıldı. Dokular enzimatik ve mekanik olarak tek hücreli süspansiyonlara ayrıldı, ardından filtreleme, canlılık değerlendirmesi ve tek hücreli transkriptom kütüphanelerinin oluşturulması yapıldı. Kalite kontrolünden geçen kütüphaneler diziliyor ve ham veriler hücre nicelendirmesi ve kalite filtreleme için işleniliyor, düşük kaliteli hücreler ve teknik artefaktlar ortadan kaldırılıyordu. Normalizasyon ve boyut küçültmesinden sonra, hücreler belirlenmiş belirteç genlerine göre kümelenmiş ve notlandırılmıştır. Sonraki analizler, gangliyonik ve agangliyonik dokular arasındaki hücre tipi bileşimini karşılaştırdı ve anahtar bağışıklık hücresi alt kümelerinde farklı şekilde eksprese edilen genleri belirledi. Sonuçlar, HSCR'de gangliyonik ve agangliyonik segmentler arasındaki bağışıklık mikroçevresinde önemli farklılıklar ortaya koymaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hirschsprung hastalığı (HSCR), en yaygın doğuştan gelen bağırsak motilite bozukluklarından biridir ve dünya genelinde yaklaşık her 5.000 canlı doğumda 1. Hastalık, 5–12. embriyonik haftalarda enterik sinir krest hücrelerinin (ENCC) distal bağırsağa göç edememesinden kaynaklanır ve etkilenen segmentlerde enterik ganglionlarınyokluğuna yol açar 2. Agangliyonik segment bu nedenle kalıcı spastik kasılma ve bozulmuş peristaltik belirtiler, bu da proksimal bağırsak genişlemesine yol açar. Klinik olarak bu, fonksiyonel tıkanıklık olarak ortaya çıkar; kabızlık, karın dartımı ve kusmaya neden olur ve ağır vakalarda hayati tehlike oluşturabilir. Aganiyonik segmentin cerrahi rezeksiyonu, HSCR için birincil tedavi olarak kalmaktadır; Ancak, hastaların önemli bir kısmı kabızlık, enterokolit ve dışkı kirlenme gibi ameliyat sonrası komplikasyonlar yaşar ve bu komplikasyonlar yaşam kalitesini önemli ölçüdedüşürür 3. Ayrıca, uzun bağırsak rezeksiyonu sonrası kısa bağırsak sendromu (SBS) meydana gelebilir; bu da besin emiliminin bozulmasına ve klinik yönetim zorluklarının artmasına yol açabilir. Bu nedenle, HSCR'nin altta yatan mekanizmalarının aydınlatılması ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi kritik klinik ihtiyaçlar olarak kalmaktadır.

Son yıllarda, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), hastalıkla ilişkili moleküler mekanizmaların araştırılmasında yaygın olarak uygulanmıştır. Geleneksel toplu RNA dizilemesinin aksine, scRNA-seq tek hücre çözünürlükte gen ifade analizini sağlar; böylece hücresel heterojenlik ve toplu analizlerde gizlenen nadir alt popülasyonların tanımlanmasınaolanak tanır 4. Sonuç olarak, scRNA-seq hücresel heterojenliği ve hücreler arası iletişimi analiz etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmış, biyoloji ve tıpta araştırmalarıilerletmiştir 5. Bu yaklaşım, Alzheimer hastalığı6, romatoidartrit 7, akciğerkanseri 8 ve tip 2 diyabet 9 gibi karmaşık hastalıklarda yeni patojenik mekanizmalar ve terapötik hedefler ortaya koymuştur.

Bu çalışmada, HSCR hastalarından gangliyonik ve agangliyonik kolon dokularında immün-hücre transkripsiyonel manzarası ve infiltrasyon desenlerini karakterize etmek için scRNA-seq uygulanmıştır. İş akışı üç ana aşamadan oluşuyordu: tek hücreli süspansiyonların hazırlanması ve kalite değerlendirmesi, 3′ tek hücreli RNA dizili kütüphanelerinin inşası ve sonraki biyoinformatik analiz. Doku örnekleri, rezeksiyondan hemen sonra özel tek hücreli koruma çözeltisinde saklandı ve 48 saat içinde enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara ayrıldı. Hücre canlılığı %80'i aştı ve son hücre konsantrasyonu kütüphane hazırlığından önce 700–1.500 hücre/μL olarak ayarlandı. Gangliyonik ve agangliyonik segmentler arasındaki bağışıklık hücresi infiltrasyonu karşılaştırıldı ve belirgin transkripsiyonel farklılıklar gösteren bağışıklık hücre alt popülasyonları tespit edildi. Bu analizler, HSCR'de kolonik patolojiyle ilişkili bağışıklık hücresi değişikliklerini belirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Zunyi Tıp Üniversitesi Bağlı Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: KYLL-2024-030). Çalışma, Helsinki Bildirgesi'ne uygundur. Tüm katılımcılardan ve vasilerinden (sözlü ve yazılı) bilgilendirilmiş onay alındı. Tablo 1 , HSCR hastaları hakkında bilgileri sunmaktadır.

Zunyi Tıp Üniversitesi Bağlı Hastanesi Pediatrik Cerrahi Bölümü'nde teşhis edilen ve ameliyat edilen HSCR hastalarından gangliyonik ve agangliyonik segmentler dahil kolonik dokular toplanması. İki erkek HSCR hastasından gangliyonik ve agangliyonik segmentleri dahil edin. Ayrıntılı klinik bilgiler Tablo 1'de verilmiştir. Tüm reaktifler, kimyasallar, ekipmanlar ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hematoksilin ve eozin boyama

  1. Doku toplama ve fiksasyon
    1. Bağırsak dokusu örneklerini %4 paraformaldehit fiksasyon çözeltisinde en az 24 saat sabitleyin.
      DIKKAT: Paraformaldehit toksiktir ve formaldehit buharları salgılar. Tüm işlemleri kimyasal bir buhar davlumbazında gerçekleştirin ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    2. Dokuları yaklaşık 5 × 5 × 2 mm3 ölçülerine kadar bistüri ile kesin. Mendilleri kasetlere yerleştirin ve 24 saat boyunca akan musluk suyun altında durulayın.
      NOT: Doku kenarlarını çıkarın ve en az bir düz yüzeyli bloklar hazırlayın. Eğer eşit değilse, durulama sonrası filtre kağıtlarının arasına mendil koyun.
  2. Dereceli etanol dehidrasyonu
    1. Dokuları sıralı olarak etanol çözeltilerine daldırın: %70 etanol gece, %80 etanol 3 saat, %90 etanol 2 saat, %95 etanol I 2 saat, %95 etanol II 1 saat, %100 etanol I 1 saat ve %100 etanol II.
      NOT: Etanol (%≥99,7) ultrasaf suyla belirtilen konsantrasyonlara kadar seyreltin.
      DIKKAT: Etanol kullanımı kimyasal bir buhar davlumbazında yapılıyor.
    2. Dehidrasyon sepetini çıkarın ve adımlar arasında iyice boşaltın.
  3. Temizlik
    1. Şeffaflık sağlamak için dokuları 30 saniye boyunca ksilene aktarın.
  4. Parafin sızması ve gömülmesi
    1. Parafin mumunu 60 °C'de bir gün önceden erit. Taze mumu üç donma-eritme döngüsüne tabi tutup kabarcıkları çıkarın. Erimiş parafini üçüncü döngüden sonra filtre kağıdından geçirin.
    2. Dokuları saf parafin mumu (Parafin mumu I) ile 1 saat boyunca sızdırın.
    3. Parafin karışımına (Parafin mumu II; saf parafin mumu: arı balmumu = 8:1) 2 saat boyunca dokuları sızdırın.
      NOT: Kullanmadan önce balmumunu tamamen eritin ve filtreleyin.
    4. Parafin mumu II'yi kalıp kalıplarına dök. Doku bloklarını dik ve düz konuma yerleştirin, etiketler takın ve katılaşmasına izin verin.
  5. Bölümleme
    1. Parafin bloklarını keserek dokuyu kesmeden pürüzsüz yüzeyler elde etmek için kesin.
    2. Blokları mikrotomun üzerine monte edin. Yönü ayarlayın ve fazla parafini çıkarın. Seri kesitleri 4 μm kalınlıkta kesin. Bölümleri 50 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve cam kaydıraklara aktarın.
    3. Kuru kaydırmaları 60 °C sıcaklıkta fırında kalan nemi gidermek için kullanın.
      NOT: 12–48 saat boyunca kuru bölümler.
  6. Deparafinizasyon
    1. Sıralı kuluçka yapın: ksilen I (15 dakika), ksilen II (15 dakika), %100 etanol I (5 dakika), %100 etanol II (5 dakika), %90 etanol (5 dakika), %80 etanol (5 dakika), %70 etanol (5 dakika) ve damıtılmış su (5 dakika).
  7. Hematoksilin boyama
    1. Kesitleri hematoksilinle 50 saniye boyayım.
    2. Akan musluk suyunda 10 dakika durulayın.
  8. Eozin boyama
    1. Eosin ile 40 saniye lekeleme bölümleri.
  9. Susuz kalma
    1. Bölümleri sıralı olarak %95 etanol I (30 saniye), %95 etanol II (30 saniye), %100 etanol I (30 saniye) ve %100 etanol II (30 saniye) içine daldırın.
  10. Temizlik
    1. Bölümleri 10 dakika ksilen I'e, 10 dakika ksilen II'ye aktarın.
  11. Montaj ve gözlem
    1. Montaj ortamı ekleyin. Cam kapak ile örtün ve hava kabarcıklarını çıkarın.
    2. Montaj ortamının sertleşmesine izin verin. Kesitleri ışık mikroskobu altında inceleyin.

2. Tek hücreli RNA dizilemesi

  1. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
    1. Bağırsak dokularını makasla ~1mm 3 parçaya parçalayın.
    2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde 1 mg/mL kollagenaz II ve 0,1 mg/mL DNaz I içeren doku parçalarını 37 °C'de 30 dakika boyunca hafif bir sallanma platformunda (60 rpm) inkübe edin.
    3. Sindirimi, %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren eşit hacimde soğuk DMEM ekleyerek sonlandırın.
    4. Süspansiyonu 70 μm hücre süzgeciyle filtreleyin. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun.
    5. Süpernatantı atın ve hücre pelletini kalın. %0,04 sığır serum albümini (BSA) içeren fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkayın.
    6. Hücre kümelerini nazikçe pipetleme ile ayırarak tek hücreli bir süspansiyon elde edilir.
    7. Süspansiyonu 40 μm hücre süzülcüsünden filtreleyin.
    8. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika sürdüm. Süpernatantı atın ve peleti alın.
    9. %10 FBS ve %1 penisilin–streptomisin (P/S) içeren hücreleri DMEM'de yeniden süspansiyona alın.
    10. Trypan mavisi dışlanmasını kullanarak hücre canlılığını ve yoğunluğunu belirleyin. Canlı >%80 olan örnekler kullanın ve konsantrasyonu 700–1.500 hücre/μL olarak ayarlayın.
      NOT: Hücre süspansiyonunu tripan mavisi (1:1) ile karıştırın ve canlı hücreleri hemositometre ile sayın.
  2. Kütüphane hazırlığı
    1. Kütüphane hazırlığı için her çalışma başına yaklaşık 15.000 hücre yükleyin.
      NOT: Jel boncuk-emülsiyon (GEM) mikrodamlacıklarında, mRNA Jel Boncuklar üzerinde poli(dT) oligonukleotidlere hibritleşir.
    2. PCR ile ters transkripsiyon ve cDNA'yı amplifikasyon (95 °C 10 dakika; 40 döngü 95 °C 15 saniye, 60 °C 35 saniye, 72 °C 25 saniye; son uzatma 72 °C 25 saniye). 3′ scRNA-seq kütüphanesi yapımı için amplifikasyonlu cDNA kullanın.
      NOT: cDNA sentezi sırasında bir CCC çıkıntısı eklenir ve şablon anahtarlama oligonukleotid (TSO) dizisiyle eşleşir.
    3. Emülsiyonları kırın ve GEM'lerden cDNA'yı geri kazanın.
  3. Kütüphane kalite kontrolü ve sıralama
    1. Gen ifadesini niceleştirin ve parça boyut dağılımını değerlendirin.
    2. Floresan bir qPCR cihazı kullanarak doğru nicelik gerçekleştirin.
      NOT: Kütüphane konsantrasyonu ≥10 nM.
    3. Dizileme aracı kullanarak dizis kütüphaneleri.
      NOT: Okuma yapısı: Okuma 1 (26 bp), Okuma 2 (91 bp), i7 indeksi (8 bp); Hedef derinliği hücre başına ~50.000 okuma.
  4. Veri QC
    1. Ham okumaları referans veritabanına hizala. UMI sayımı yapın ve hücre gen matris oluşturun.
    2. Sonuçları aşağı akış analizi için AnnData (Annotated Data) formatında aktarın.
    3. UMI'ler, gen sayıları ve mitokondriyal okumalara dayalı kalite kontrol filtreleri yapın.
      NOT: Çift topları çıkarın (Scrublet); <200 veya >5.000 gen, total_counts >40.000 veya mt_ratio >20% genli hücreleri hariç tutun.
  5. Boyutluluk küçültme ve açıklama
    1. Benzersiz Moleküler Tanımlayıcı (UMI) sayısını hücre başına 10.000'e normalize edin.
    2. Oldukça değişken genleri belirleyin.
    3. Ana bileşen analizi (PCA) yapın.
    4. K-en yakın komşu grafiği oluşturun.
    5. UMAP gömme işlemi yapın.
    6. Scanpy'deki Leiden algoritmasını kullanarak küme hücreleri (v1.9.3).
      NOT: sc.pp.neighbors ve sc.tl.leiden kullanın (çözünürlük = 0.5).
    7. Hücre tiplerini tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) verilerinde otomatik, yüksek hassasiyetli açıklama için tasarlanmış bir araç kullanarak annotasyon yapın.
  6. Diferansiyel analiz
    1. Seurat (v4.3.0) kullanarak R (v4.2.2) içinde diferansiyel gen ekspresyonu analizi yapın.
      NOT: Wilcoxon sıralama toplamı testiyle birlikte FindMarkers fonksiyonunu kullanın.
    2. EnrichGO ile clusterProfiler (v4.8.1) kullanarak GO zenginleştirme analizi yapın.
      NOT: CC, MF ve BP kategorilerini içerir.
    3. ClusterProfiler (v4.8.1) ile enrichKEGG10 ile KEGG yol zenginleştirme analizi yapın.

3. Atık bertaraf

  1. Paraformaldehit ve ksilen içeren atıkları ayrı ayrı toplayın.
  2. Uygun olduğunda asidik çözeltileri nötralize edin veya tehlikeli atık olarak bertaraf edin.
  3. Kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği (EHS) düzenlemelerine uyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematoksilin ve eozin (HE) boyama (Şekil 1), gangliyonik ve agangliyonik segmentler arasında belirgin histolojik farklılıklar ortaya koydu. Gangliyonik segmentlerle karşılaştırıldığında, agangliyonik segmentlerde mukozal eksfoliasyon artışı, kadeh hücrelerinde ve submukozal nöronların belirgin azalması ve mukozal ile kas katmanları arasındaki sınırlar bulanıklaşmıştır. Bazı bölümlerde doku koruması optimal değildi; kısmi epitelyal ayrılma ve doku mimarisinin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hirschsprung hastalığı olan hastalardan cerrahi olarak rezek edilen kolon dokularının (gangliyonik ve agangliyonik segmentler) transkripsiyonel özelliklerinin profiline tek hücreli RNAdizileme uygulanmıştır 4,5. Özellikle doku ayrışma stratejisine dikkat edildi; çünkü ayrışma parametreleri hücre iyileşmesini, hücre tipi temsilini ve RNA bütünlüğünü etkiler. Enzimatik sindirim koşulları, yeterli doku ayrışmasını hücre canlılığı ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Guizhou Bilim ve Teknoloji Projesi (Guizhou Bilim ve Teknoloji İş Birliği - Vakfı - ZK - [2024] General 344) (X.F. Yang'a) ve Zunyi Bilim ve Teknoloji Proje Sözleşmesi (Bilim ve Teknoloji İşbirliği) (Zunyi Bilim ve Teknoloji İşbirliği HZ (2023) No.) tarafından desteklenmiştir. (Y. Qu'ya).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BalmumuSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
BalmumuSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Sığır serum albüminiTermobalıkçı30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
Sığır serum albüminiTermobalıkçı30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
CellTypistYokNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
CellTypistYokNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
Küme profiler paketiBiyoiletkenv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Küme profiler paketiBiyoiletkenv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Kollagenaz IITermobalıkçı17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Kollagenaz IITermobalıkçı17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Kapak camıCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Kapak camıCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Tek kullanımlık mikrotom bıçağıTüyS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
Tek kullanımlık mikrotom bıçağıTüyS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNase ITermobalıkçı18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
DNase ITermobalıkçı18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
Kurutma fırınıBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Kurutma fırınıBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Dulbecco' s Modifiye Kartal OrtaTermobalıkçı12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Dulbecco' s Modifiye Kartal OrtaTermobalıkçı12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Etil alkolSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Etil alkolSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Fetal sığır serumuTermobalıkçıA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Fetal sığır serumuTermobalıkçıA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Hematoksilin ve eozin boyama kitiBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
Hematoksilin ve eozin boyama kitiBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
Hidroklorik asitSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Hidroklorik asitSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Mikroskop slaytıCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Mikroskop slaytıCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Montaj ortamıBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Montaj ortamıBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Optik mikroskopNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Optik mikroskopNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Parafin mumu  Sinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Parafin mumu  Sinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Paraformaldehit Fix SolutionBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Paraformaldehit Fix SolutionBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Penisilin ve dash; StreptomisinTermobalıkçı15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Penisilin ve dash; StreptomisinTermobalıkçı15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Fosfatla tamponlanmış tuzlu suTermobalıkçı10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Fosfatla tamponlanmış tuzlu suTermobalıkçı10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Niteliksel filtre kağıdıSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Niteliksel filtre kağıdıSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
R yazılım paketiR İstatistiksel Hesaplama Vakfıv4.2.2https://www.r-project.org/
R yazılım paketiR İstatistiksel Hesaplama Vakfıv4.2.2https://www.r-project.org/
Döner MikrotomLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Döner MikrotomLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
ScanpyTopluluk tarafından geliştirilenv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
ScanpyTopluluk tarafından geliştirilenv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Doku kurutucuWuhan Junjie Elektronik Şirketi, Ltd.JT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Doku kurutucuWuhan Junjie Elektronik Şirketi, Ltd.JT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Doku göme makinesiWuhan Junjie Elektronik Şirketi, Ltd.JB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Doku göme makinesiWuhan Junjie Elektronik Şirketi, Ltd.JB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Trypan blue SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
Trypan blue SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
KsilenSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
KsilenSinopharm Kimyasal Reaktif CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montalva, L., et al. Hirschsprung disease. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 54 (2023).
  2. Morera, C., Nurko, S. Hirschsprung's disease management. Aliment Pharmacol Ther. 60 Suppl 1, S66-S76 (2024).
  3. Kyrklund, K., et al. ERNICA guidelines for the management of rectosigmoid Hirschsprung's disease. Orphanet J Rare Dis. 15 (1), 164 (2020).
  4. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
  5. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970 (2023).
  6. Mathys, H., et al. Single-cell multiregion dissection of Alzheimer's disease. Nature. 632 (8026), 858-868 (2024).
  7. Wu, X., et al. Single-cell sequencing of immune cells from anticitrullinated peptide antibody positive and negative rheumatoid arthritis. Nat Commun. 12 (1), 4977 (2021).
  8. Maynard, A., et al. Therapy-induced evolution of human lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing. Cell. 182 (5), 1232-1251.e22 (2020).
  9. Lee, H., et al. Immunological link between periodontitis and type 2 diabetes deciphered by single-cell RNA analysis. Clin Transl Med. 13 (12), e1503 (2023).
  10. Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
  11. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient culture of human naive and memory B cells for use as APCs. J Immunol. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  12. Cancro, M. P., Tomayko, M. M. Memory B cells and plasma cells: the differentiative continuum of humoral immunity. Immunol Rev. 303 (1), 72-82 (2021).
  13. Weisel, N. M., et al. Surface phenotypes of naive and memory B cells in mouse and human tissues. Nat Immunol. 23 (1), 135-145 (2022).
  14. Phelps, A., et al. Production and use of antigen tetramers to study antigen-specific B cells. Nat Protoc. 19 (3), 727-751 (2024).
  15. Wu, X. Z., et al. Activated naive B cells promote development of malignant pleural effusion by differential regulation of Th1 and Th17 response. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 315 (3), L443-L455 (2018).
  16. Chien, C. H., Chiang, B. L. Regulatory T cells induced by B cells: a novel subpopulation of regulatory T cells. J Biomed Sci. 24 (1), 86 (2017).
  17. Tan, Z., et al. Comprehensive analysis of scRNA-seq and bulk RNA-seq reveals dynamic changes in the tumor immune microenvironment of bladder cancer and establishes a prognostic model. J Transl Med. 21 (1), 223 (2023).
  18. Ding, Q., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq, bulk RNA-seq, Mendelian randomization, and eQTL reveals T cell-related nomogram model and subtype classification in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 15, 1399856 (2024).
  19. Guo, S., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq unravels T cell-related prognostic risk model and tumor immune microenvironment modulation in triple-negative breast cancer. Comput Biol Med. 161, 107066 (2023).
  20. Zhang, C., et al. Comprehensive analyses of brain cell communications based on multiple scRNA-seq and snRNA-seq datasets for revealing novel mechanisms in neurodegenerative diseases. CNS Neurosci Ther. 29 (10), 2775-2786 (2023).
  21. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 81 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gangliyonik KolonAgangliyonik KolonGen Ekspresyon ProfillemeEnterik N ronlarH cre Tipi Kompozisyonumm n MikroortamDoku DisosiyasyonuDiferansiyel Gen Ekspresyonu

İlgili makaleler