Eupatorium lindleyanum DC'den alınan sesquiterpene laktonlarının antiinflamatuar etkileri. Kemirgen Modelleri

Özet

Bu çalışma, Eupatorium lindleyanum DC'den alınan sesquiterpene laktonlarının olduğunu göstermektedir. (SLEL), histopatolojik hasarı hafifleterek, sitokin salınımını azaltarak ve NF-κB sinyal aktivasyonunu inhibe ederek ksilen kaynaklı fare kulak ödemi ve karragenle indüklenen fare pençe ödemi modellerinde önemli antiinflamatuar etkiler uygular.

Özet

Akut iltihap, birçok bağışıklık kaynaklı hastalıkta yer alan temel bir patolojik süreçtir. Eupatorium lindleyanum DC., geleneksel bir tıbbi bitki olup, sesquiterpene laktonları (SLEL) açısından zengindir ve farmakolojik etkinlik gösterdiği bildirilmiştir; ancak antiinflamatuar etkileri ve ilişkili moleküler değişiklikleri henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, ksilen kaynaklı fare kulak ödemi modeli ve karragenan kaynaklı fare pençe ödemi modelinde akut inflamatuar yanıtlar indüklenmiştir. Doku hasarı ve inflamatuar infiltrasyon hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirildi. Proinflamatuar sitokinlerin (TNF-α, IL-6 ve IL-1β) seviyeleri serumda ELISA ile nicelendirildi ve iltihaplı dokularda transkripsiyonel ekspresyonları nicel PCR (qPCR) ile analiz edildi. NF-κB yolu ile ilişkili proteinlerdeki değişiklikler, fosforile IκBα ve p65 dahil Western blotting ile değerlendirildi. SLEL tedavisi, kulak ve pati ödemini azaltmış ve doku ödemi, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve damar tıkanıklığı gibi akut iltihaplanmanın histopatolojik özelliklerini hafifletmiştir. Paralel olarak, SLEL uygulaması serum seviyelerinin azalması ve Tnf-α, Il-6 ve Il-1β doku mRNA ekspresyonuyla ilişkilendirildi. Western blot analizi, SLEL tedavisinden sonra iltihaplı dokularda IκBα ve p65'in fosforilasyonunun azaldığını gösterdi ve bu da NF-κB ile ilişkili sinyal olaylarının modülasyonunu gösterdi. Bu bulgular birlikte, SLEL'in akut iltihap modellerinde anti-enflamatuar aktivitesini değerlendirmek için deneysel bir iş akışını göstermekte ve etkilerinin azalmış pro-inflamatuar sitokin ifadesi ve NF-κB yolu ile ilgili sinyalin değişimiyle ilişkili olduğunu öne sürmektedir.

Giriş

İltihaplanma, patojenik istila veya doku hasarı tarafından tetiklenen karmaşık bir savunma yanıtıdır ve enfeksiyonu sınırlamada, zararlı uyarıcıların ortadan kalkmasında ve doku onarımını teşvik etmede kritik bir rol^oynar. Kontrollü inflamatuar yanıtlar doku homeostazını korumak için hayati öneme sahip olsa da, aşırı veya kalıcı iltihap doku hasarına, organ işlev bozukluğuna ve kronik hastalıkların ilerlemesine yol açabilir. Klinik olarak, iltihap kızarıklık, şişlik, ısı ve ağrıyla karakterize edilir ve ağır vakalarda sistemik patolojik yanıtlara yol açabilir. Artan kanıtlar, düzensiz iltihapı kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve otoimmün hastalıkların gelişimiyle ilişkilendirmektedir²˒³.

Steroid olmayan anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID'ler), şu anda iltihabı yönetmek için en yaygın kullanılan ajanlardır. Semptomların hafifletilmesindeki etkinliğine rağmen, uzun süreli NSAID kullanımı sıklıkla gastrointestinal tahriş, aşırı duyarlılık reaksiyonları ve hepatotoksisite⁴ gibi yan etkilerle ilişkilidir; bu da klinik uygulanabilirliklerini sınırlar. Sonuç olarak, geliştirilmiş güvenlik profillerine sahip alternatif antiinflamatuar ajanların belirlenmesine yönelik ilgi artmaktadır. Geleneksel bitkisel ilaçlar da dahil olmak üzere doğal ürünler, immünomodülatör özelliklere sahip biyoaktif bileşiklerin potansiyel kaynakları olarak araştırılmıştır. Ancak, düşük toksisite veya sistemik düzenleyici işlevlerle ilgili genel iddialar dikkatli yorumlanmalı ve tanımlanmış hastalık modellerinde deneysel doğrulama^{gerektirmelidir 5}.

Eupatorium lindleyanum DC. geleneksel bir tıbbi bitkidir ve karakteristik fitokimyasalları arasında sesquiterpene laktonları, özellikle guaianolid ve eudesmanolid tipi bileşikler, ayrıca germakranolidler ve ksantanolidler^bulunur. Eupatorium lindleyanum DC Özetleri. çeşitli deneysel ortamlarda lipid düşürücü, antiaterosklerotik, antitümör ve antiinflamatuar aktiviteler gösterdiği^{bildirilmiştir 6}. Özellikle, Eupatorium lindleyanum DC'nin etanol özleri lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı akut akciğer hasarı modellerinde koruyucu etkiler^{göstermiştir 7}. Ancak, SLEL'in antiinflamatuar etkinliği ve klasik akut iltihap modellerindeki etkileri hâlâ yeterince tanımlanmamıştır.

Bu boşluğu gidermek için iki tamamlayıcı akut iltihap modeli kullandık: farelerde ksilen kaynaklı kulak ödemi, hızlı nörojenik ve damar inflamatuar yanıtları yakalıyor; ve sitokin üretimi ile hücresel sızıntıyı içeren zamana bağlı akut iltihabı yansıtan iyi kurulmuş bir model olan farelerde karragenan kaynaklı pençe ödemi. LPS kaynaklı sistemik iltihap gibi alternatif modeller, lokalize doku ödemi yerine sistemik bağışıklık aktivasyonuna vurgu yapmaları ve eşleştirilmiş doku düzeyinde histolojik ve moleküler analizler için sınırlı uygunlukları nedeniyle^{seçilmedi 8}.

Bu birleşik model stratejisi kullanılarak, inflamatuar yanıtlar niceliksel ödem ölçümleri, hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ile histopatolojik değerlendirme, serum sitokin profilleme, doku düzeyinde transkripsiyonel analiz ve NF-κB ile ilişkili protein değişiklikleri yoluyla değerlendirildi. Bu protokol, özellikle akut iltihabda antiinflamatuar aktivite taraması için uygundur; burada ödem oluşumu, sitokin ifadesi ve yol bağlantılı moleküler okumalar ilgi çekici olur. Buna rağmen, akut modellerin sınırlamaları kabul edilmelidir; kronik inflamatuar durumlara sınırlı ekstrapolasyon ve doku düzeyindeki sinyal değişikliklerinden nedensellik çıkarırken yorumlayıcı sınırlar da vardır.

Bu çalışma, tamamlayıcı akut iltihaplanma modellerini eşleştirilmiş histolojik ve moleküler analizlerle bütünleştiren, bitkisel kaynaklı bileşiklerin antiinflamatuar potansiyelini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlayan protokol odaklı bir yaklaşımı vurguluyor.

Protokol

Hayvan çalışması protokolü, Chongqing Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC-CQMU-2025-10073) tarafından onaylanmıştır.

Sesquiterpene lakton-zenginleştirilmiş fraksiyonun (SLEL) hazırlanması

Eupatorium lindleyanum DC'nin kurutulmuş tıbbi maddeleri. Düşük basınçta %70 (v/v) etanol ile 2 kez reflü ekstraksiyonuna maruz bırakıldı. Her ekstraksiyon, 2 saat boyunca 10:1 (v/w) çözücü-malzeme oranıyla yapıldı. Birleşik özetler filtrelenip ≤60 °C'de azaltılmış basınç altında konsantre edildi ve ardından ham etanol ekstraktı tozu elde etmek için vakumda dondurularak kurutuldu.

Kurutulmuş ekstrakt, damıtılmış suda tamamen çözündürüldü (nihai konsantrasyon: 100 mg/mL) ve sıralı olarak poliamid reçine kromatografisine maruz bırakıldı, ardından sesquiterpene laktonlarını zenginleştirmek için D101 makrogözenekli adsorpsiyon reçine kromatografisi yapıldı. Adsorbüm dengesi sağlandıktan sonra, D101 reçineyi kutup safsızlıklarını gidermek için damıtılmış su ile yıkanır ve ardından susuz etanol ile elütör edilir. Etanol elülasyonu sonrası, toplanan fraksiyon azaltılmış basınç altında yoğunlaştırılır ve SLEL fraksiyonu elde edilmek için dondurularak kurutma işlemi yapılır; SLEL fraksiyonu −20 °C'de saklanır ve kullanıma kadar saklanır.

Ayrım, asetonitril ve %0,1 (v/v) formik asit içeren ikili mobil faz sistemi kullanılarak bir UPLC platformunda gerçekleştirildi. Gradyent programı, düşük organik içerikte ilk 25 dakikalık izokratik tutma, %70 asetonitrile kısa bir doğrusal rampa, %90 asetonitrile yüksek organik basamak aşaması ve başlangıç koşullarına dönüş son dengeleme aşamasından oluşuyordu. Sistem, 35 °C sütun sıcaklığı ve 0,1 μL enjeksiyon hacmiyle 0,25 mL·^min⁻1 hızında çalıştırıldı (Ek Şekil S1).

Hayvanlar

Bu çalışmada toplam 36 erkek Sprague–Dawley faresi (200 ± 20 g) ve 36 erkek BALB/c faresi (20 ± 2 g) kullanıldı. Hayvanlar standart koşullarda (22 ± 2 °C, 55 ± %5 nem, 12 saat ışık/karanlık döngü) ve serbest yiyecek ve suya erişim sağlanıyordu. Hayvanlar deneyden önce 7 gün boyunca uyum sağladı ve genel sağlık açısından günlük olarak izlendi. Tüm işlemler hayvan acısını en aza indirmek için yapıldı ve kan alımı ile doku hasadı öncesinde anestezi uygulandı.

Farelerde ksilen kaynaklı kulak ödemi

Fare kulak ödemi modeli, daha önce açıklandığı gibi^{kurulmuştur 9}. Alışma sonrası fareler rastgele olarak altı gruba (n = 6 grup başına ayrıldı): kontrol (CG), model (MG), deksametazon (DEX, 10 mg/kg) ve SLEL düşük dozlu (75 mg/kg), orta dozlu (150 mg/kg) ve yüksek dozlu (300 mg/kg) gruplar. Tüm tedaviler, 7 gün ardışık olarak günde bir kez oral gavaja ile uygulandı (nihai doz hacmi: 10 mL/kg). Son uygulamadan 1,5 saat sonra, kontrol grubu hariç sağ kulağın her iki yüzeyine 30 μL ksilen eşit şekilde uygulanarak iltihap indüklenmiştir. Otuz dakika sonra fareler anestezi edildi, kan örnekleri alındı ve her iki kulağın aynı anatomik pozisyonlarından 8 mm dairesel kulak yumrukları alındı.

Farelerde karragenan kaynaklı pati ödemi

Fare pençesi ödemi modeli, daha önce tanımlandığı gibi karragen kullanılarak^{oluşturulmuştur 10}. Fareler rastgele olarak altı gruba (n = 6 grup başına yerleştirildi): CG, MG, DEX (5 mg/kg) ve SLEL düşük doz (50 mg/kg), orta doz (100 mg/kg) ve yüksek doz (200 mg/kg) gruplar. Tedaviler günde bir kez 7 gün boyunca (10 mL/kg) ağızdan uygulandı. Son dozdan önce temel pençe hacimleri ölçüldü. Son uygulamadan otuz dakika sonra, 0,1 mL %1 (w/v) karragenan solüsyeni sağ arka patinin plantar yüzeyine deri altı enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra 1, 2, 3 ve 4 saat içinde pençe hacimleri pletismometre kullanılarak ölçüldü. Paw ödemi şu şekilde hesaplandı:

Paw ödemi (%) = (Vt − V0) / V0 ×% 100

Histolojik muayene

Fonksiyonel değerlendirmelerden hemen sonra kulak ve pati dokuları toplandı. Dokular, oda sıcaklığında %10 nötr tamponlu formalinde 72 saat boyunca sabitlenmiş, parafine gömülü, 5 μm kesitlenmiş ve standart^{protokoller 11'e} göre H&E ile boyanmıştır.

Enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA)

Serum örnekleri 3.000 × g sıcaklıkta, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle alındı. TNF-α, IL-6 ve IL-1β seviyeleri, standart protokollere göre ticari olarak mevcut ELISA kitleri kullanılarak nicelendirildi.

Western Blot analizi

Kulak ve pati dokularından toplam protein özleri, RIPA lizis tamponu kullanılarak proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle desteklenerek hazırlanmıştır. Protein konsantrasyonları BCA testi kullanılarak nicelendirildi ve eşit miktarda protein (örnek başına 30 μg) SDS-PAGE ile çözülerek PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar oda sıcaklığında %5 yağsız sütle 1 saat bloklandı, ardından gece boyunca 4 °C'de birincil antikorlarla ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP ile konjuge ikincil antikorlarla inkubasyon yapıldı. İmmünoreaktif bantlar, geliştirilmiş kemilyüminsans kullanılarak tespit edildi ve ImageJ yazılımıyla nicelendirildi.

Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)

Toplam RNA, Materyaller Tablosu'nda listelenen RNA ekstraksiyon reaktifiyle kulak ve pati dokularından izole edildi. Toplam RNA'nın bir mikrogramı, üreticinin talimatlarına göre ticari bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak cDNA'ya ters transkribe edildi. Nicel PCR, SYBR Green kimyası, gen spesifik primerlerle (Tablo 1) 10 μL reaksiyon hacminde, iki aşamalı amplifikasyon protokolü altında gerçekleştirildi. Ayrıntılı ters transkripsiyon koşulları ve PCR döngüsü parametreleri Protokol bölümünde sunulmaktadır. Göreceli transkript seviyeleri 2^⁻ΔΔCT yöntemiyle hesaplandı ve Gapdh dahili referans gen olarak kullanıldı.

Veri ve istatistiksel analiz

Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. İki grup arasında istatistiksel karşılaştırmalar eşleşmemiş Student's t-testi kullanılarak yapılırken, iki gruptan fazla olan analizlerde tek yönlü ANOVA uygulanmıştır. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlandı. Anlamlılık, kontrol grubuna (CG) karşı # p < 0.05 ve ## p < 0.01 , model grubuna (MG) karşı * p < 0.05 ve ** p < 0.01 olarak gösterilir.

Sonuçlar

SLEL'de UPLC-Q/TOF/MSn ile kimyasal bileşim

SLEL'in kimyasal profili, pozitif ve negatif iyon modlarında UPLC-Q/TOF-MSn kullanılarak incelendi. Dokuz sesquiterpene laktonu baskın bileşenler olarak tanımlanmıştır (Ek Şekil S1). Moleküler formül atamaları, pozitif modda [M+H]⁺ ve [M+Na]⁺ ile negatif modda [M−H]⁻ ve [M+HCOO]⁻ gibi gözlemlenen addukt iyonlardan türetilmiştir (Ek Tablo S1).

Ksilen kaynaklı kulak ...

Tartışma

Bu çalışmada, Eupatorium lindleyanum DC'den sesquiterpene laktonları kullanılmıştır. (SLEL) iki yerleşik akut iltihap modeli kullanılarak değerlendirildi: farelerde ksilen kaynaklı kulak ödemi ve farelerde karragen kaynaklı pençe ödemi. Histopatolojik puanlama, serum sitokin ölçümleri, doku düzeyinde mRNA nicelendirmesi ve protein düzeyinde sinyal okumalarını içererek, bu protokol tek bir deneysel iş akışında yerel ve sistemik inflamatuar yanıtların çok katmanlı karakterizasyonu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
anti GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anti IΚ Bα	Hücre Sinyal Teknolojisi	4812
anti P65	Abmart	TA5006
anti p-Iκ Bα	Hücre Sinyal Teknolojisi	2859
Anti P-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	P10010
IL-1β Kit	Xiamen Huijia Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	EHJ-20537r
IL-6 kiti	Xiamen Huijia Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	EHJ-20746r
Mikropipet	Eppendorf
Microplate okuyucu	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Ters transkripsiyon kiti	MedChemExpress	HY-K051A
RIPA tamponu	Beyotime Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	P0013B
SYBR Yeşil Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-α Kit	Xiamen Huijia Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	EHJ-20039r
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Ultra düşük sıcaklıklı dondurucu	SANYO