Siyasal Transkriptomik Veri Analizi İçin Pratik Bir İş Akışı: Veri Eldesinden İleri Analizlere

Özet

Bu protokol, kamuya açık veri edinimi ve Seurat tabanlı kalite kontrolden başlayarak entegrasyon, mekânsal özellik tespiti, hücre tipi dekonvolsiyonu, ilgi bölgesi anotasyonu ve hücre-hücre iletişimi analizine kadar uzanan, şeffaf yürütmeyi destekleyen pratik kontrol noktalarıyla birlikte, mekânsal transkriptomik verilerin analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Özet

Uzamsal transkriptomik (ST), doku kesitleri içindeki mRNA moleküllerinin iki boyutlu uzamsal bağlamını koruyarak genom genelindeki gen ifadesini profiller ve böylece doku mimarisi ve mikroçevreyle ilişkili biyolojinin incelenmesine olanak tanır. Ancak, veri aktarımı, kalite kontrolü, entegrasyon, dekonvolüsyon, uzamsal istatistikler ve görselleştirme genellikle birden fazla yazılım ortamı ve tekrarlanabilir parametre seçimleri gerektirdiğinden, ST analizi zorlayıcı olmaya devam etmektedir. Bu protokol, veri edinimi ve yazılım kurulumu ile başlayıp Seurat tabanlı veri yükleme, kalite kontrolü, normalizasyon, çoklu örnek entegrasyonu, kümeleme ve uzamsal olarak değişken gen analizi ile devam eden, R dilinde halka açık ST veri setleri için pratik bir hesaplama iş akışı sunmaktadır. İş akışı daha sonra, referans kılavuzlu SPOTlight analizi ve denetimsiz STdeconvolve konu modellemesini içeren tamamlayıcı dekonvolüsyon stratejilerini, ardından Giotto tabanlı uzamsal hücre-hücre iletişimi analizini ve özel bir Python Dash uygulaması kullanılarak etkileşimli ilgi alanı (ROI) seçimini uygular. Betik tabanlı yürütmeye, açık parametre gerekçelerine, beklenen çıktılara ve sorun giderme kontrol noktalarına vurgu yapan bu protokol, veri setine ve platforma özgü parametre değerlendirmesinden sonra, standart dizi tabanlı ST veri setleri ve ilgili platformlar için uyarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Giriş

Uzamsal transkriptomik (ST), doku kesitlerindeki haberci RNA (mRNA) moleküllerinin uzamsal koordinatlarını korurken genom genelindeki gen ekspresyonunu ölçen dönüştürücü bir teknoloji ailesidir. ST yöntemleri, konum barkodlu diziler kullanan sekanslama tabanlı yaklaşımları ve bozulmamış doku mikroortamlarındaki transkripsiyonel sinyalleri haritalayan in situ görüntüleme yaklaşımlarını içerir^1,2. Uzamsal bağlamı koruyarak ST; doku mimarisinin, hücresel komşuluk organizasyonunun, hücre-hücre iletişiminin ve doku disosyasyonundan sonra tam olarak çözümlenemeyen mikroortamla ilişkili biyolojik süreçlerin analizine olanak tanır³.

Kamuya açık ST veri depolarının hızla büyümesi, ikincil analizler ve yöntem geliştirme için benzeri görülmemiş fırsatlar yaratmıştır³. CROST veri tabanı gibi kaynaklar, birden fazla tür ve teknoloji platformunda yüzlerce mekânsal olarak çözünürlemiş transkriptomik veri setini derlerken, STOmicsDB gibi özel koleksiyonlar Stereo-seq gibi belirli metodolojilere odaklanmaktadır^4,5. Bu veri bolluğuna rağmen, mekânsal veri yapılarının karmaşıklığı, analitik araçların çeşitliliği ve tekrarlanabilir iş akışlarının uygulanmasındaki teknik engeller nedeniyle hesaplamalı analizler zorlayıcı olmaya devam etmektedir^{6,7,8,9,10,11}.

Tek bir yazılım ortamına güvenmenin getirdiği sınırlamaları gidermek amacıyla, burada tamamlayıcı analitik araçlar kullanan entegre bir hesaplamalı iş akışı sunulmaktadır. Mevcut kapsamlı ST analiz ekosistemleri temel olarak Seurat, Giotto ve Squidpy^6,7,12 gibi Python tabanlı çerçeveleri içermektedir. Squidpy gibi Python tabanlı araçlar uzaysal grafik analizi için kapsamlı işlevler sunsa da temel hesaplama hattının tek bir programlama dili ortamında birleştirilmesi, diller arası teknik engelleri en aza indirir. Bu nedenle, diller arası teknik engelleri azaltmak için ana işlem hattı temel olarak R dilinde uygulanmıştır. Tek hücreli ve uzaysal transkriptomik iş akışlarındaki yaygın kullanımını yansıtacak şekilde, bu R tabanlı iş akışında Seurat; veri yükleme, kalite kontrol, normalizasyon, boyut indirgeme, görselleştirme ve çoklu örnek entegrasyonu için kullanılmıştır. Daha sonra, uzaysal ağ kurulumu ve ligand-reseptör tabanlı hücre-hücre iletişimi analizi için Giotto kullanılmıştır. Dolayısıyla bu işlem hattı, iki araç seti arasındaki veri transferini açık ve tekrarlanabilir tutarken, Seurat tabanlı ön işleme ve entegrasyonu Giotto tabanlı uzaysal analizle ilişkilendirmektedir.

Bu çerçeve kapsamında, iki tamamlayıcı dekonvolüsyon stratejisi uygulanmaktadır: hücre tipi oranlarını tahmin etmek için scRNA-seq verilerini kullanan referans kılavuzlu bir yöntem olan SPOTlight ve gizli transkripsiyonel paternleri tanımlayan denetimsiz bir konu modelleme yöntemi olan STdeconvolve^8,11. Elde edilen çıktılar, mekânsal hücresel heterojenliğe dair birbirini tamamlayıcı görünümler sunar; ancak kullanıcılar protokolde açıklanan isteğe bağlı uyumluluk analizini gerçekleştirmediği sürece bunlar nicel bir çapraz doğrulama olarak değerlendirilmez. İnteraktif ilgi alanı (ROI) anotasyonu için özel bir Python Dash uygulaması olan Select Spatial Spots entegre edilmiştir ve bu uygulama, sonraki alt analizlerde kullanılabilecek standart koordinat tabanlı anotasyon dosyaları dışa aktarır.

Pratik uygulanabilirlik açısından, bu iş akışı öncelikle standart dizi tabanlı ST verileri (örneğin, 55 µm çözünürlüklü Visium) için tasarlanmıştır ve parametre değerlendirmesinin ardından diğer doku türlerine uyarlanabilir. Analizden önce temel sınırlamalar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, referans kılavuzlu dekonvolüsyon modülü, yüksek kaliteli ve dokuyla eşleşen bir scRNA-seq referansına bağlıdır. İkinci olarak, hücre altı veya tek hücreye yakın platformlar, entegrasyon öncesinde modifiye edilmiş ön işleme, mekansal kutucuk agregasyonu veya görüntü tabanlı hücre segmentasyonu gerektirebilir². Temsili fare kolon veri seti, evrensel platform uyumluluğunun bir kanıtı olarak değil, iş akışının mekansal alanları ve belirteçle tanımlanmış doku organizasyonunu nasıl değerlendirebileceğini göstermek için bir gösterim vakası olarak kullanılmıştır.

Protokol

Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik veri setleri halka açıktır ve yalnızca gösterim amacıyla kullanılmıştır. Belirli veri erişim numaraları ve kaynak depoları ilgili adımlarda belirtilmiştir. Orijinal veri setleri, her bir kaynak çalışma için geçerli olan kurumsal etik yönergelerle uyumlu olarak orijinal araştırmacılar tarafından oluşturulmuştur. Gerekli tüm yazılım ve R-paket versiyonlarını doğrulamak için Materyal Tablosuna bakınız.

Donanım gereksinimleri: Bu iş akışı için gereken hesaplama belleği, analiz edilen örnek ve nokta sayısına bağlı olarak değişir. Tipik bir uzamsal transkriptomik veri seti için (örneğin, üç örneğe kadar örnek başına yaklaşık 3.000 nokta), bor hattını yürütmek için minimum 16 GB RAM'e sahip standart bir iş istasyonu yeterlidir. Bununla birlikte, özellikle SCTransform normalizasyonu ve dekonvolüsyon sırasındaki matris faktörizasyonu gibi bellek yoğun hesaplama adımları sırasında optimal performans ve kararlılığı sağlamak için 32 GB RAM veya daha fazlası şiddetle önerilir.

1. Veri toplama ve dizin yapısının hazırlanması

1. Kamuya açık mekansal transkriptomik veri setlerini (örneğin, 26 Mart 2021 gönderim tarihli ve 6 Mart 2022 son güncelleme tarihli GEO erişim numarası GSE169749) ve tek hücreli RNA-seq referans verilerini (örneğin, 19 Nisan 2024 gönderim tarihli ve 10 Aralık 2024 son güncelleme tarihli GEO erişim numarası GSE264408) edinin.
2. Ham veri arşivini (örneğin, GSE169749_RAW.tar) depodan indirin ve arşivi ayıklayın.
   NOT: Bu protokolde kullanılan temsilci veri seti için, ayıklanan dizin her örnek için birden fazla dosya içerir ve dosya adları genellikle GEO örnek erişim numarasını (örneğin, GSM5213483) kapsar.
3. Dosyaları, Seurat Load10X_Spatial fonksiyonu ile uyumlu standartlaştırılmış bir dizin yapısında düzenleyin.
   1. Bir ana veri dizini oluşturun (örneğin, ./data/).
   2. Her örnek için özel bir alt dizin oluşturun (örneğin, ./data/sample_A1/).
   3. Her örnek için aşağıdaki temel dosyaları ilgili alt dizine aktarın (kopyalayın veya taşıyın).
      1. filtered_feature_bc_matrix.h5 dosyasını örneğin ana alt dizinine yerleştirin.
      2. Her örnek dizini içinde bir spatial/ alt klasörü oluşturun.
      3. Aşağıdaki dosyaları spatial/ alt klasörüne yerleştirin: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz ve tissue_hires_image.png.gz.
   4. spatial/ klasöründeki .gz dosyalarını açın. Orijinal dosya adlarının Load10X_Spatial fonksiyonunun gerektirdiği şekilde kalmasını sağlayın (örneğin, tissue_positions_list.csv).
      NOT: Sorunsuz yükleme için nihai düzenlenmiş yapı, örnek A1 kullanılarak şu şablonu izlemelidir:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. Yazılım ortamının kurulumu

1. R'yi (versiyon 4.4.3 veya üzeri) kurun.
2. Analiz betiklerini (1_ReadSpatialData.R'den 8_Giotto_Communication.R'ye kadar), GitHub deposundan (tekrar üretilebilirlik için 2d85e18 commit hash'inde https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow adresinden) temin edin.
3. setup.R betiğini çalıştırarak CRAN ve Bioconductor üzerinden gerekli R paketlerini kurun.
   NOT: Bu iş akışında kullanılan spesifik paket versiyonlarının kapsamlı bir listesi Malzeme Tablosunda sunulmuş olup, aynı zamanda ilgili GitHub deposundaki (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow) session_info.txt dosyasında da mevcuttur.
4. Resmi dokümantasyonda verilen kurulum komutlarını çalıştırarak Giotto Suite kurulumunu yapın.
   1. Kurulum betiklerini almak için resmi kurulum URL'sine gidin: https://giottosuite.com/articles/installation.html
   2. Adım adım talimatlara uygun olarak gerekli Python ortamını ve sistem bağımlılıklarını başlatın.
5. Gelişmiş görselleştirme için ek paketleri kurun.
   1. Şunu çalıştırın: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
6. Özel Select Spatial Spots aracını kurun. İşletim sisteminin Windows, macOS veya Linux olduğundan ve Python versiyon 3.8 veya üzerinin kurulu olduğundan emin olun. Bu adım isteğe bağlıdır.
   1. GitHub deposuna giderek (tekrar üretilebilirlik için d20946e commit hash'inde https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots adresinden) kaynak kodunu indirip aracı temin edin.
   2. Aracın dizinine gidin ve Python bağımlılıklarını kurun: pip install -r requirements.txt
7. SCTransform normalizasyonunu hızlandırmak için BiocManager::install("glmGamPoi") komutunu çalıştırarak glmGamPoi paketini kurun.
   NOT: Temel iş akışı yalnızca 2.1–2.3 ve 2.6 adımlarında listelenen paketleri gerektirir. Rfast2 paketi, Moran's I istatistiğinin hesaplamasını hızlandırmak için kullanılır. 2.5 adımındaki isteğe bağlı paketler, prism tarzı bir tema ile yayına hazır grafikler oluşturmak (ggprism) ve renk körlüğü dostu bir palete erişmek (colorBlindness) içindir. 2.6 adımındaki araç, etkileşimli spot seçme işlevselliğini sağlar. sessionInfo() komutunu çalıştırın ve tüm konsol çıktısını bir metin dosyasına kaydedin. Bu işlem, uzun vadeli tekrar üretilebilirliği sağlamak için kritik olan kesin yazılım versiyonlarını ve paket bağımlılıklarını belgeler.

3. Mekansal verilerin yüklenmesi ve kalite kontrolü (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. Uzamsal verileri Seurat nesnelerine aktarın.
   1. image.dir ve image.name değerlerini belirterek, yüksek çözünürlüklü doku görüntüsünü manuel olarak yüklemek için Read10X_Image fonksiyonunu kullanın.
   2. Seurat nesnesini oluşturmak için image parametresini adım 3.1.1'de oluşturulan görüntü nesnesine ayarlayarak Load10X_Spatial fonksiyonunu kullanın.
2. Kalite kontrol metriklerini hesaplayın.
   1. ^mt- deseni ile PercentageFeatureSet kullanarak mitokondriyal okuma yüzdesini hesaplayın.
3. Verileri QC metriklerine göre görselleştirin ve yorumlayın.
   1. VlnPlot kullanarak nCount_Spatial, nFeature_Spatial ve percent.mt
   2. Doku alanı dışındaki spotları belirlemek için SpatialFeaturePlot kullanarak bu metriklerin uzamsal özellik grafiklerini oluşturun.
      NOT: Görsel kontrol noktası: Doku alanı dışındaki spotlar genellikle düşük UMI sayıları (nCount_Spatial < 500) ve düşük gen tespiti (nFeature_Spatial < 200) sergiler.
   3. Gösterim amaçlı olarak, düşük kaliteli spotları kaldırmak için filtreler uygulayın (örneğin, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Bu isteğe bağlı bir adımdır.
      NOT: Uzamsal transkriptomikte QC'nin temel amacı, doku dışındaki spotlar gibi teknik artefaktları belirlemek ve işaretlemektir. Gösterim için kullanılan Visium kolon verilerinde, nFeature_Spatial > 200 ve nCount_Spatial > 500 değerleri düşük kompleksiteli/arka plan spotlarını temizler. Düşük RNA içeriğine sahip veya degrade olmuş kesitli dokularda, eşikleri yükseltmeden önce keman ve uzamsal özellik grafiklerini inceleyin; yoğun veya yüksek UMI'li dokular için daha katı eşikler uygun olabilir. Dubletler, doku katlanmaları veya belirgin artefaktlar görülmedikçe yalnızca yüksek ekspresyon değerlerine göre filtreleme yapmaktan kaçının. Filtreleme, uzamsal konumları fiziksel olarak kaldırdığı ve bu durumun sonraki uzamsal analizler için doku yapısının sürekliliğini bozabileceği nedeniyle genellikle önerilmez.

4. Veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme (3_IntegrationAndClustering.R)

1. Bireysel örnekleri normalize edin ve ön işlemeden geçirin.
   1. SCTransform normalizasyonunu, assay = parametresini kullanarak her bir örneğe ayrı ayrı uygulayın. Konumsal.
2. Birden fazla örneği entegre edin.
   1. Entegrasyon için SCT-normalleştirilmiş nesne listesini hazırlayın. Her bir nesnenin şunlara sahip olduğundan emin olun: "RNA" ...kopyalayarak analiz edin "Uzamsal" analiz: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Uzamsal"]]
      ​NOT: Kopyalama işlemi "Mekansal" bir standarda karşı analiz/test/deneyle karşılaştırma "RNA" analiz yuvası, başlangıçta tek hücreli Seurat nesneleri için tasarlanmış olan alt akış entegrasyon fonksiyonlarıyla uyumluluğu sağlamak için gerekli bir geçici çözüm işlevi görmektedir.
   2. Kullanım Entegrasyon Özelliklerini Seçin ve PrepSCTIntegration ortak değişken özellikleri belirlemek için.
   3. şunları kullanarak entegrasyon çapaları bulun: Entegrasyon Çapaları Bulma ile normalizasyon.yöntemi = "SCT".
   4. IntegrateData ile verileri şu şekilde entegre edin: normalizasyon.yöntemi = "SCT".
3. Entegre analiz üzerinde boyut indirgeme ve kümeleme işlemlerini gerçekleştirin.
   1. Entegre edilmiş veriler üzerinde şu yöntemi kullanarak PCA gerçekleştirin: PCA'yı Çalıştır.
   2. Kümülatif açıklanan varyansı hesaplayarak, sonraki analizler için optimal temel bileşen (PC) sayısını belirleyin. Şuradaki kodu kullanarak, dirsek noktasını programatik olarak (örneğin, kümülatif varyansın %90'ı aştığı ve marjinal kazancın %0,1'in altına düştüğü nokta) tespit edin. 3_EntegrasyonVeKümeleme.R, satırlar 36-38Elde edilen temel bileşen (PC) sayısı bundan sonra şu şekilde adlandırılacaktır: pc.use.
   3. RunUMAP'ı şununla çalıştırın: boyutlar = 1:pc.use.
   4. Hücreleri şunları kullanarak kümeleyin: KomşularıBul ile dims = 1:pc.use ve FindClusters ile çözünürlük = 0,5Çözünürlüğü yalnızca küme kararlılığı ve belirteç gen tutarlılığı incelendikten sonra ayarlayın.
   5. Hedef gruplar arasında (örneğin, "B1_kolon_d14" karşı "A1_kolon_g0") kullanarak Markerleri Belirleme işlev
      ​NOT: Görsel kontrol noktası: Başarılı bir entegrasyon, biyolojik olarak farklı kümeler korunurken UMAP grafiğinde örneklerin uygun şekilde karıştığını gösterecektir.
4. Mekansal olarak değişken genleri belirleyin.
   1. Her bir orijinal örnek için çalıştırın MekansalOlarakDeğişkenÖzellikleriBul kullanarak "moransi" yöntemi üzerine "SCT" uzamsal otokorelasyonu hesaplamak için analiz.

5. Tek hücreli referans veri ön işlemesi (4_scDataPreProcessing.R)

1. Read10X kullanarak tek hücreli RNA-seq sayım matrisini okuyun ve bir Seurat nesnesi oluşturun.
2. Standart kalite kontrol (QC), normalizasyon ve kümeleme işlemlerini gerçekleştirin.
   1. Mitokondriyal okuma yüzdesini (percent.mt) hesaplayın ve hücreleri filtreleyin (örneğin, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
   2. vars.to.regress = "percent.mt" parametresini ayarlayarak verileri SCTransform ile normalize edin.
   3. PCA ve UMAP analizlerini çalıştırın ve hücreleri adım 4.3.2'de açıklanan dinamik PC seçim yöntemini kullanarak kümeleyin.
3. Hücre tiplerini açıklayın (annote edin).
   1. AddModuleScore kullanarak kanonik hücre tipi belirteç genleri için modül skorlarını hesaplayın.
   2. Kümeleri modül skorlarına ve bilinen biyolojik verilere dayanarak açıklayın. Alternatif olarak, önceden hesaplanmış açıklamaları metadata'dan içe aktarın.

6. SPOTlight ile Referans Rehberli Dekonvolüsyon (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. SPOTlight için verileri hazırlayın.
   1. Açıklamalı tek hücreli Seurat nesnesini ve mekansal Seurat nesnesini SingleCellExperiment nesnelerine dönüştürün.
   2. Tek hücreli verileri logNormCounts kullanarak log-normalize edin.
2. SPOTlight dekonvolüsyonunu çalıştırın.
   1. modelGeneVar ve getTopHVGs kullanarak tek hücreli veriler üzerindeki hipervariable genleri (HVG'ler) belirleyin.
   2. scoreMarkers kullanarak hücre tipi marker genlerini hesaplayın ve yüksek kaliteli markerlar için filtreleme yapın (örneğin, mean.AUC > 0.8).
   3. Hesaplama süresini azaltmak için her hücre tipi için tek hücreli referansı yönetilebilir bir sayıya (örneğin, 50 hücre) indirgeyin (downsample).
   4. weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster" ve gene_id = "gene" parametreleri ile SPOTlight fonksiyonunu kullanarak dekonvolüsyonu gerçekleştirin.
3. Sonuçları görselleştirin ve dışa aktarın.
   1. Dekonvolüsyon sonuç matrisini (spot başına hücre tipi oranları) çıkarın.
   2. Hücresel kompozisyonu mekansal koordinatlarda görselleştirmek için plotSpatialScatterpie kullanın.
   3. AddMetaData kullanarak dekonvolüsyon sonuçlarını mekansal Seurat nesnesinin metadata kısmına ekleyin. Beklenen çıktı: her bir mekansal spot için hücre tipi oranı sütunlarını içeren bir dekonvolüsyon matrisi, yerel hücresel kompozisyonu gösteren mekansal scatterpie grafikleri ve dekonvolüsyon oranlarını metadata olarak içeren bir Seurat nesnesi.

7. STdeconvolve ile Referanssız Dekonvolüsyon (7_STdeconvolve.R)

1. Uzamsal verileri hazırlayın.
   1. Uzamsal Seurat nesnesinden ham sayım matrisini slot = "counts" ile GetAssayData kullanarak çıkarın.
   2. STdeconvolve içindeki cleanCounts fonksiyonunu kullanarak düşük kaliteli spotları ve genleri kaldırın (örneğin, min.lib.size = 100).
2. Gizli hücre tiplerini belirleyin.
   1. Minimum spot fraksiyonunda eksprese edilen genler için korpusu restrictCorpus kullanarak daha fazla filtreleyin (örneğin, removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
   2. fitLDA kullanarak bir dizi potansiyel konu sayısı (K) üzerinden (örneğin, Ks = seq(2, 9, by = 1)) bir Gizli Dirichlet Tahsisi (LDA) modeli uydurun.
   3. opt = "min" ile optimalModel kullanarak minimum perplexity'ye dayalı optimal modeli seçin.
3. Sonuçları analiz edin ve görselleştirin.
   1. Optimal modelden hücre tipi (konu) oranlarını (theta) ve gen profillerini (beta) getBetaTheta kullanarak çıkarın.
   2. Dekonvolüye edilmiş konuların biyolojik yorumuna yardımcı olmak için, "Select Spatial Spots" aracı tarafından oluşturulan ilgi alanı (ROI) anotasyonlarını içe aktarın (bkz. adım 9.3.3). Dekonvolüye edilmiş hücre tipi oranlarını tekrar uzamsal koordinatlar üzerine yansıtmak ve spotları ROI'lerine göre renk kodlamak için bu anotasyonları vizAllTopics fonksiyonunda groups parametresi olarak kullanın. Bu isteğe bağlı bir adımdır.
      NOT: Beklenen çıktı: STdeconvolve, spot başına konu oranlarını temsil eden theta değerlerini ve her konu için gen profillerini temsil eden beta değerlerini döndürmelidir. Kullanıcılar, gözetimsiz STdeconvolve sonuçlarını referans kılavuzlu SPOTlight çıktılarıyla (Adım 6'dan) nicel olarak karşılaştırmak isterlerse, her iki oran matrisini de (STdeconvolve'dan theta ve SPOTlight matrisi) dışa aktarabilir ve standart R fonksiyonlarını kullanarak spot başına korelasyon veya uyum metriklerini (örneğin, Pearson veya Spearman korelasyonu) hesaplayabilirler. SPOTlight ve STdeconvolve arasındaki nicel karşılaştırma isteğe bağlıdır ve temel iş akışının yürütülmesi için gerekli değildir; ancak, böyle bir analiz yapmak isteyen kullanıcılar için ilgili çıktı matrisleri Adım 6.3.1 ve 7.3.1'de mevcuttur.

8. Giotto kullanarak mekansal hücre-hücre iletişimi(8_Giotto_Communication.R)

1. Seurat nesnesini bir Giotto nesnesine dönüştürün.
   1. Ham sayım matrisini ve uzaysal koordinatları sağlayarak createGiottoObject fonksiyonunu kullanın.
2. Giotto nesnesini ön işlemeden geçirin ve dekonvolüsyon sonuçlarını ekleyin.
   1. normalizeGiotto kullanarak verileri normalize edin.
   2. addCellMetadata kullanarak hücre tipi anotasyonlarını (örneğin, SPOTlight dekonvolüsyonundan elde edilen ana hücre tipi) hücre meta verilerine ekleyin.
3. Uzaysal bilgiye dayalı hücre-hücre iletişimini çıkarın.
   1. method = "Delaunay" ve name = "Delaunay_network" parametreleri ile createSpatialNetwork kullanarak bir uzaysal ağ oluşturun.
   2. R ortamına bir ligand-reseptör veri tabanı yükleyin. Yüklenen nesnenin, ligand ve reseptör gen sembollerini temsil eden iki ayrı sütuna sahip bir veri çerçevesi (data frame) şeklinde biçimlendirildiğinden emin olun (örneğin, Zenodo'dan önceden derlenmiş bir fare ağı: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versiyon v6, 7 Nisan 2025 tarihinde yayınlanmıştır).
   3. Uzaysal yakınlıkta bulunan hücre tipleri arasındaki anlamlı ligand-reseptör etkileşimlerini belirlemek için cluster_column = "celltype_major" parametresiyle exprCellCellcom fonksiyonunu çalıştırın. Beklenen çıktı: ligand-reseptör çiftlerini, kaynak ve hedef hücre tipi kombinasyonlarını, log2 kat değişim (fold-change) değerlerini ve düzeltilmiş P değerlerini içeren bir sonuç tablosudur; görselleştirme için anlamlı etkileşimleri (örneğin, p.adj < 0.05) saklayın.

9. select spatial spots ile interaktif nokta seçimi (6_SelectSpatialSpots.R)

1. İnteraktif araç için verileri hazırlayın.
   1. GetTissueCoordinates kullanarak Seurat nesnesinden uzaysal koordinatları çıkarın.
2. Verileri formatlayın ve dışa aktarın.
   1. Koordinat veri çerçevesini (data frame), tam olarak şu sütun başlıklarını içerecek şekilde formatlayın: CELL_ID, X ve Y.
   2. Formatlanmış veri çerçevesini bir CSV dosyasına aktarın.
3. İlgi alanı (ROI) analizini gerçekleştirin.
   1. Özel Select Spatial Spots Dash uygulamasını başlatın ve CSV dosyasını yükleyin.
   2. Uzaysal konuma göre noktaları interaktif olarak seçin.
   3. Seçilen noktaların listesini ve atanan grup/ROI etiketlerini yeni bir CSV dosyası olarak dışa aktarın. Beklenen çıktı: nokta tanımlayıcıları, X/Y koordinatları ve CELL_ID aracılığıyla Seurat nesnesiyle tekrar eşleştirilebilecek atanmış grup/ROI etiketlerini içeren bir CSV dosyasıdır.

Sonuçlar

İş akışı uygulaması ve veri entegrasyonu, temel doku özelliklerini örneklendirmektedir

Analitik aşamalar boyunca beklenen çıktıları göstermek amacıyla, hesaplama iş akışı fare kolon uzamsal transkriptomik verilerine uygulanmıştır. İş akışı şemasında (Şekil 1) gösterildiği gibi, boru hattı; uzamsal özellik grafiklerinin doku sınırlarını belirlediği (Şekil 2A,B) veri edinimi ve kalite kontrolü ile başlamıştır. Ardından, yorumlanabilir biyolojik varyasyonu korurken teknik grup etkilerini azaltmak için Seurat'ın çapa tabanlı entegrasyon iş akışı kullanılmıştır. UMAP görselleştirmeleri, entegrasyon sonrası örnek hizalamasını ve uzamsal kümelenme modellerini göstermiştir (Şekil 2C,D). Boyut indirgeme ve sonraki kümelenme aşamalarına rehberlik etmek için kümülatif varyansa dayalı temel bileşenlerin (PC'ler) kantitatif, dinamik seçimi uygulanmıştır (bkz. Ek Şekil 1). Markör gen ısı haritası analizi, uzamsal kümelerin temelini oluşturan belirgin transkripsiyonel profilleri ortaya koymuştur (Şekil 2E).

Hesaplamalı kümelerin kolon histolojisinin bilinen anatomik mimarisiyle tutarlı olup olmadığını değerlendirmek için, kanonik tabaka spesifik belirteç genlerinin ekspresyon profilleri incelenmiştir. Mukozal epitel tabakası, goblet hücre belirteci Muc2'nin yanı sıra Epcam ve Krt8 dahil olmak üzere epitel hücre belirteçlerinin ekspresyonunu göstermiştir. Col1a1 ve Vim gibi mezenkimal ve stromal belirteçler lamina propria ve submukozal bölgeleri işaretlerken, dış muscularis propria tabakası Acta2 ve Tagln gibi düz kas yapısal genleri tarafından belirtilmiştir. Bu soy odaklı belirteçlerin uzamsal kısıtlaması, entegrasyon ve kümeleme iş akışının, kolon dokusunun mukozadan muscularis'e uzanan eksen boyunca temel histolojik laminasyonlarını koruduğu yorumunu desteklemektedir (bkz. Supplementary Figure 2).

Küme doğrulamasının ardından, deneysel koşullar arasındaki diferansiyel olarak ifade edilen genleri (DEGs) belirlemek için aşağı akış diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirildi (Şekil 2F,G). Ayrıca, Moran's I istatistiği kullanılarak mekânsal olarak değişken genler belirlendi ve böylece doku genelinde anlamlı şekilde rastgele olmayan mekânsal dağılıma sahip genler vurgulandı (Şekil 2H).

Hücresel dekonvolüsyon ve mekansal etkileşim ağları doku mikroorganizasyonunu ortaya çıkarır

Tek hücreli RNA-seq referans verilerinin işlenmesi; QC filtreleme (Şekil 3A), denetimsiz kümeleme (Şekil 3B), marka gen doğrulaması (Şekil 3C) ve bağımsız anotasyonlarla uyumluluk (Şekil 3D) ile desteklenen anotasyonlar sağlamıştır. Hücresel kompozisyon (Şekil 3E), dekonvolüsyon için alt örnekleme stratejisine temel oluşturmuştur. SPOTlight, mekansal spotlar genelinde referans kılavuzlu hücre tipi oranlarını tahmin ederken (Şekil 4A,B), STdeconvolve mekansal hücresel modellerin denetimsiz bir konu modelleme görünümünü sunmuştur (Şekil 5B). Özel Select Spatial Spots aracı, bu modeller için histolojik bağlam sağlamıştır (Şekil 5A). Son olarak, dekonvolüsyonla belirlenen hücre tipi atamaları kullanılarak yapılan mekansal iletişim analizi, mekansal olarak yakın hücre tipi grupları arasındaki ligand-reseptör etkileşimlerini tanımlamıştır (Şekil 6A,B).

Protokol optimizasyonundan elde edilen sorun giderme gözlemleri

Protokol optimizasyonu sırasında, pratik kontrol noktalarının belirlenmesine temel oluşturan birkaç sorun tespit edilmiştir. Tek hücre referanslarının doku bağlamıyla zayıf eşleştiği durumlarda suboptimal dekonvolüsyon sonuçları ortaya çıkmıştır; bu durum, mevcut olduğunda doku ve tür ile eşleşmiş scRNA-seq verilerinin kullanılması gerektiğini göstermektedir. Varsayılan parametrelerle yapılan ilk kümeleme denemeleri, beklenen biyolojik yapıları her zaman çözümleyememiştir; PC seçiminin, kümeleme çözünürlüğünün ve belirteç gen tutarlılığının incelenmesi, doku anatomisi ile uyumlu, mekansal olarak yorumlanabilir alanların tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Bu gözlemler, kullanıcıların iş akışının yürütülmesi sırasında yaygın analitik sorunları nasıl teşhis edebileceklerine dair pratik örnekler sunmaktadır.

Şekil 1: Entegre mekansal transkriptomik analiz iş akışı. Veri elde etme ve ön işlemeden gelişmiş mekansal analizlere kadar olan analitik boru hattının şematik gösterimi. Temel adımlar şunlardır: (1) Verilerin yüklenmesi, kalite kontrolü ve Seurat kullanılarak çok örneklemli entegrasyon; (2) Mekansal kümeleme ve mekansal olarak değişken genlerin tespiti; (3) Referans tabanlı (SPOTlight) ve denetimsiz (STdeconvolve) yöntemler via aracılığıyla hücre tipi dekonvolüsyonu; (4) Giotto ile mekansal hücre-hücre etkileşimi analizi ve özel bir araç olan Select Spatial Spots kullanılarak etkileşimli ilgi bölgesi seçimi. Tüm modüllerden elde edilen sonuçlar, doku mimarisi ve hücresel mikroçevre hakkında biyolojik içgörüler elde etmek için sentezlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2Veri entegrasyonu, kümeleme ve diferansiyel ekspresyon analizi. (A,B) Gen sayıları, UMI sayıları ve mitokondriyal gen yüzdelerinin dağılımlarını gösteren A1 ve B1 spatial örnekler için kalite kontrol metrikleri. (C) Entegre edilmiş uzamsal transkriptomik verilerin, örnek kökenine (sol) ve kümelenme kimliğine (sağ) göre renklendirilmiş UMAP görselleştirmesi. (D) Küme kimliklerinin doku kesitleri üzerine uzamsal projeksiyonu. (E) Her bir mekânsal küme için en üst düzey marker genlerin ısı haritası. (F) A1_colon_d0 ve B1_colon_d14 koşulları arasında farklı şekilde eksprese edilen genleri gösteren volkan grafiği. (G) Doku kesitleri genelinde temsili diferansiyel eksprese genlerin uzamsal ekspresyon paternleri. (H) Tanımlanan en üst düzeyce mekansal değişken genlerin mekansal ekspresyon haritaları aracılığıyla Sol iki panelin A1_colon_d0 örneğindeki genleri, sağ iki panelin ise B1_colon_d14 örneğindeki genleri gösterdiği Moran'ın I istatistiği. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.

Şekil 3: Tek hücre referans veri işleme ve anotasyon. (A) Filtreleme öncesi ve sonrası scRNA-seq referans verileri için kalite kontrol metrikleri. (B) Denetimsiz kümelerle renklendirilmiş scRNA-seq verilerinin UMAP görselleştirmesi. (C) Kümeler genelinde kanonik hücre tipi belirteç genlerinin ekspresyon skorlarını gösteren nokta grafiği. (D) Ana hücre tiplerinin etiketlendiği scRNA-seq verilerinin anotasyonlu UMAP görselleştirmesi. (E) scRNA-seq referans veri setinin hücresel kompozisyonu. Kesikli kırmızı çizgi, hesaplama verimliliği ve hücre tipi temsilini dengelemek için SPOTlight dekonvülsiyonu sırasında uygulanan alt örnekleme eşiğini (tip başına n = 50 hücre) belirtir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hücresel heterojenliğin konumsal dekonvolüsyonu.(A,B) A1 (A) ve B1 (B) örnekleri için her bir spotta ana hücre tiplerinin oransal kompozisyonunu gösteren SPOTlight dekonvolüsyonundan elde edilen konumsal scatterpie grafikleri. (C) A1 (sol) ve B1 (sağ) örneklerinde B hücrelerinin temsilci konumsal dağılımı, dekonvolüsyon yoluyla tanımlanan spesifik bir bağışıklık hücresi popülasyonunun konumsal olarak çözümlenmiş lokalizasyon modellerini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İnteraktif ilgi alanı analizi ve denetimsiz dekonvolüsyon karşılaştırması. (A) Proksimal kolon, distal kolon ve diğer doku alanlarına karşılık gelen bölgelerin interaktif seçimini gösteren özel "Spatyal Noktaları Seç" aracının arayüzü. (B) Örnek A1 için denetimsiz dekonvolüsyon sonuçlarının (STdeconvolve) spatyal scatterpie görselleştirmesi; noktalar (A) kısmındaki manuel olarak işaretlenmiş bölgelere göre renklendirilmiş olup, histoloji tabanlı açıklama ile hesaplama yoluyla türetilen hücre konu dağılımları arasındaki uygunluğu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Mekansal olarak bilgilendirilmiş hücre-hücre iletişim ağları. (A,B) A1 (A) ve B1 (B) örnekleri için Giotto tarafından çıkarılan ligand-reseptör etkileşim ağları. Düğümler hücre tiplerini, kenarlar anlamlı ligand-reseptör çiftlerini (FDR < 0.05) temsil eder ve kenar kalınlığı etkileşim gücüyle orantılıdır. Karşılaştırılabilirliği ve görselleştirme netliğini sağlamak için tüm örneklerde tek tip bir anlamlılık eşiği (FDR < 0.05) uygulanmış ve her durum için log2FC'ye göre sıralanan ilk 20 etkileşim görüntülenmiştir. Ağlar, kolon dokusunun mekansal bağlamındaki hücre tipine özgü iletişim modellerini vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Boyut indirgeme için parametre optimizasyonunun kantitatif değerlendirmesi. Dirsek grafiği, optimal temel bileşen (PC) sayısını dinamik olarak seçmek için iş akışının programatik yaklaşımını göstermektedir. Seçim, aşağı yönlü kümeleme öncesinde teknik gürültüyü azaltırken biyolojik varyansı yakalamak amacıyla, kırmızı dikey çizgi ile temsil edilen kümülatif standart sapma ve marjinal varyans eşiklerine göre hesaplanmıştır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Kanonik kolon tabakasına özgü belirteçler kullanılarak uzaysal kümelenmenin doğrulanması. (A) Hesaplamalı kümeler genelinde epitel, stromal ve düz kas belirteçlerinin zenginleşmiş ekspresyonunu gösteren nokta grafiği. (B) Temsili belirteçlerin (Epcam, Col1a1, Acta2) doku koordinatlarına geri eşlendiği uzaysal özellik grafikleri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, analitik derinlik ile pratik erişilebilirliği dengeleyen, mekansal transkriptomik veri analizi için kapsamlı bir hesaplamalı iş akışı sunmaktadır. Adım adım ilerleyen bu yaklaşım, kritik karar noktalarını ve olası pitfalls'leri vurgularken, araştırmacıya başlangıç veri ediniminden gelişmiş mekansal analizlere kadar tüm analitik hatt boyunca rehberlik eder.

Protokoldeki birkaç adım, sonraki sonuçlar üzerindeki etkileri nedeniyle özel dikkat gerektirmektedir. Kalite kontrol ve filtreleme eşikleri, belirli doku tiplerine ve teknoloji platformlarına göre dikkatlice ayarlanmalıdır; çünkü aşırı katı filtreleme biyolojik olarak ilgili noktaları ortadan kaldırabilirken, gevşek eşikler teknik gürültüye yol açabilir. Normalizasyon yöntemi seçimi, sonraki kümeleme ve diferansiyel ekspresyon sonuçlarını önemli ölçüde etkiler. Örneğin, standart log-normalizasyon yerine SCTransform kullanılmıştır; çünkü SCTransform'un tek hücreli ve mekansal iş akışlarında sekanslama derinliği ve diğer teknik etkilerle ilgili teknik varyasyonu modellediği ve azalttığı bildirilmiştir^14,15. Entegrasyon sırasında, entegrasyon özelliklerinin ve çözünürlük parametrelerinin seçimi, entegrasyon gücü ile biyolojik sinyalin korunması arasındaki dengeyi sağlamak için dikkatle değerlendirilmelidir. Mekansal olarak değişken gen belirleme işlemi için, veri seti boyutuna ve çalışma hedeflerine bağlı olarak SPARK gibi alternatif belirleyiciler değerlendirilebilse de, hesaplama ölçeklenebilirliği ve dizi tabanlı verilerde mekansal otokorelasyon analizine uygunluğu nedeniyle Moran's I seçilmiştir¹⁶.

Bu iş akışının sorun giderme bileşeni, çıktıların bir paketten diğerine aktarılması sırasında meydana gelen yaygın birlikte çalışabilirlik sorunlarına odaklanmaktadır. İş akışı, tek bir genel dönüştürme adımına güvenmek yerine, her yazılım arayüzünde özelleştirilmiş format dönüştürmeleri kullanır: uzamsal sayım verileri Seurat entegrasyonundan önce standart bir RNA analiz yuvasına kopyalanır; Seurat ve tek hücre referans nesneleri SPOTlight için SingleCellExperiment nesnelerine dönüştürülür; uzamsal sayım matrisleri STdeconvolve için yeniden formatlanır; Seurat kaynaklı sayımlar, koordinatlar ve hücre tipi meta verileri hücre-hücre iletişimi analizi için bir Giotto nesnesine dönüştürülür ve Select Spatial Spots'tan gelen ROI anotasyonları, Seurat nesnesine geri eşlenebilmeleri için CELL_ID, X/Y koordinatları ve grup etiketlerini içeren CSV dosyaları olarak dışa aktarılır. Bu adımlar, kullanıcıların uyumsuz analiz yuvaları, eşleşmeyen spot tanımlayıcıları, eksik meta veri sütunları, hatalı koordinat formatlama ve ligand-reseptör gen sembolü uyumsuzlukları gibi yaygın sorunları tanımlamalarına ve düzeltmelerine yardımcı olur.

Bu iş akışının ek bir özelliği, tek bir algoritmaya güvenmek yerine birbirini tamamlayan iki farklı dekonvolüsyon stratejisinin kullanılmasıdır. SPOTlight, hücre tipi oranlarının referans kılavuzlu tahmini için önceden belirlenmiş scRNA-seq referanslarını kullanırken, STdeconvolve latent transkripsiyonel konuların referanssız şekilde keşfedilmesine olanak tanır. Demonstrasyon veri setinde, STdeconvolve konuları histolojik olarak tanımlanmış bölgelerle uyum göstermiştir (Şekil 5B), bu da biyolojik yorumlanabilirliği desteklemektedir. Bu protokolde iki yöntem arasında doğrudan kantitatif bir karşılaştırma yapılmamıştır; bu yöntemleri kendi verileri üzerinde kıyaslamak isteyen kullanıcılar, protokol adım 7.3.2'de sunulan çerçeveyi takip edebilirler. Ayrıca protokol, temel fonksiyonlar için script'ler kullanırken sezgisel ROI izolasyonu için grafiksel bir arayüz (Select Spatial Spots) sunarak kullanılabilirliği ve izlenebilirliği desteklemektedir.

Seurat ve Giotto'nun birbirine bağlanması, iş akışının Seurat tabanlı ön işlemeyi ve entegrasyonu, Giotto tabanlı mekânsal istatistikler ve ağ analizi ile birleştirmesine olanak tanır. Seurat, scRNA-seq deneyimi olan araştırmacılar için yerleşik bir ortam sağlar ve çoklu örnek entegrasyonunu destekler; uyumlaştırılmış verilerin Giotto'ya aktarılması ise mekânsal ağ oluşturulmasına ve ligand-reseptör analizine imkan verir. Bu tasarım, kullanıcıların her iki platformun belgelenmiş güçlü yönlerinden yararlanmasını sağlar; ancak bu durum, platformların burada Squidpy veya diğer çerçevelerle kıyaslandığı anlamına gelmez. Hücre-hücre iletişimi için, aynı analiz ortamında mekânsal komşuluğu dahil ettiği için Giotto'nun Delaunay ağı tabanlı ligand-reseptör çıkarımı kullanılmıştır; CellChat gibi çerçeveler kapsamlı sinyal veri tabanları sunmaktadır ancak bu protokolde değerlendirilmemiştir¹⁷.

Bazı kısıtlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Referans tabanlı dekonvolüsyon yaklaşımı, yüksek kaliteli ve eşleşmiş tek hücre referanslarının mevcudiyetine kritik düzeyde bağımlıdır. Ayrıca, hücre-hücre iletişimi analizinin temelindeki varsayımlar, fiziksel protein etkileşimi için bir vekil olarak transkript ko-ekspresyonuna dayanır ve bu durum daha sonra deneysel doğrulamayı gerektirir. Son olarak, bu iş akışı öncelikle standart Visium veri setleri etrafında geliştirilmiştir. Alan, Visium HD gibi tek hücreye yakın çözünürlükteki teknolojilere doğru ilerledikçe, analitik değerlendirmeler değişecektir; daha yüksek çözünürlüklü veriler farklı ön işlem parametreleri gerektirebilir ve spot dekonvolüsyonuna duyulan mutlak ihtiyacı azaltabilir. Bu iş akışını Visium HD veri setlerine uyarlamak için, yüksek çözünürlüklü bin'ler hesaplamalı olarak daha büyük mekansal bin'ler şeklinde birleştirilebilir veya spot dekonvolüsyon modülleri yerine görüntü tabanlı hücre segmentasyonu tercih edilebilir¹⁸.

Bu özellikler; gelişimsel biyoloji, nörobilim, kanser araştırmaları ve immünoloji dahil olmak üzere çeşitli biyolojik alanlarda potansiyel uygulanabilirliğe işaret etmektedir^19,20,21,22. Modüler tasarım, araştırmacıların ister uzamsal alan tanımlamaya, ister hücresel iletişime veya bölgesel uzmanlaşmaya odaklansınlar, belirli bileşenleri kendi ihtiyaçlarına göre uyarlamalarına olanak tanır. Uzamsal teknolojiler gelişmeye ve veri setleri genişlemeye devam ederken, bu protokol, yeni analitik yöntemleri bünyesine katabilecek ve ortaya çıkan biyolojik soruları yanıtlayabilecek genişletilebilir bir temel sunmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	Gelişmiş veri görselleştirme
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	Uzamsal ağ ve hücre-hücre iletişimi analizi
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	Grafik kompozisyonu ve düzenleme
R software	R Foundation for Statistical Computing	v4.4.3	Çekirdek yürütme ortamı (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	Tek hücreli kalite kontrolü ve görselleştirme
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	Tek hücreli varyans modelleme ve belirteç tespiti
Select Spatial Spots (Özel Python Aracı)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	Etkileşimli uzamsal ilgi alanı (ROI) seçimi (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	Uzamsal veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	Tek hücreli ve uzamsal veriler için veri yapıları
SingleCellExperiment	Bioconductor Core Team	v1.28.1 (Bioconductor)	scRNA-seq için standartlaştırılmış veri konteyneri
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	Referans kılavuzlu uzamsal dekonvolüsyon
Stdeconvolve	Jean Fan Lab	v1.3.2 (Bioconductor)	Denetimsiz gizli konu modelleme
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	Çekirdek veri manipülasyonu ve biçimlendirme paketi