Düşük Girişli CRISPR Genom Düzenleme ve Süspansiyon T Hücreleri ile 3D Hücre Modellerinde mRNA Transfeksiyonu için Dijital Mikrofluidik Elektroporasyon Platformu

Özet

Bu protokol, birincil insan T hücrelerinde TCRα/β reseptörünün küçültülmüş CRISPR–Cas9 genom düzenlemesini 'DMF-ection' olan dijital mikrofluidik (DMF) elektroporasyon platformu kullanarak tanımlar. Bu yöntem, yüksek canlılıkla paralel, düşük girdili gen düzenlemesini mümkün kılar ve çok hücreli 3D sferoidlere mRNA iletimi için daha da uyarlanabilir.

Özet

Dijital mikrofluidik (DMF) elektroporasyon, memeli hücrelerinin hassas ve düşük hacimli genetik manipülasyonunu sağlarken, hücresel girdisini 100 katına kadar en aza indirir ve canlılığı korur. Bu çalışma, birincil insan süspansiyon T hücrelerinde TRAC lokusunun CRISPR aracılı nakatlanması ve üç boyutlu HEK293T sferoidlerin mRNA transfeksiyonu için yüksek verimli DMF tabanlı transfeksiyon iş akışını sunmaktadır. Mekansal olarak biriktirilmiş CRISPR rehber RNA'ları ve kartuş üzerindeki ribonükleoprotein (RNP) montajı kullanılarak, CD4⁺ ve CD8⁺ T hücresi popülasyonlarında yalnızca 10.000 hücre kullanılarak verimli TRAC lokus bozulması sağlandı ve düzenleme sonrası yaşamlılık %85'in üzerindeydi. Akış kaynaklı ve Taylor dispersyon analizleriyle yapılan biyofiziksel karakterizasyon, polimer katkı maddelerinin elektroporasyon tampon koşullarında Cas9–sgRNA komplekslerini stabilize ettiğini ve mikrolitre altındaki hacimlerde tekrarlanabilir düzenlemeyi desteklediğini ortaya koymuştur. İş akışı, 3D uygulamalar için de uyarlanarak EGFP mRNA'yı sağlam HEK293T sferoidlere ileterek, sferoid büyüme veya morfolojiyi bozmadan sağlam ve mekansal olarak düzgün floresans elde etti. Bu sonuçlar birlikte, DMF elektroporasyonunun hem süspansiyon bağışıklık hücreleri hem de çok hücreli sferoidler arasında verimli genom düzenleme ve mRNA iletimi sağladığını göstermektedir. Bu platform, CAR-T hücre tedavisi, fonksiyonel genomik ve gelişmiş 3D hücresel modeller uygulamalar için ölçeklenebilir ve düşük girdili bir çözüm sunar.

Giriş

Birincil insan hücrelerinde gen düzenleme, hem terapötik geliştirme hem de temel araştırmalar için giderek daha merkezi hale gelmektedir; bunlar arasında bağışıklık mühendisliği, nadir hastalık modellemesi ve fonksiyonel genomik uygulamaları da bulunmaktadır^. Elektroporasyon yüksek verimli genom düzenlemesini mümkün kılsa da, geleneksel küvet bazlı sistemler genellikle her koşul için milyonlarca hücreye kadar ihtiyaç duyar; bu da hasta kaynaklı örnekler ve nadir bağışıklık popülasyonları için kullanımlarını^sınırlar. Ayrıca, bu sistemler büyük ölçekli tarama için yeterli değildir, çünkü veri verimliliği, otomasyon ve reaktif tüketimi³.

Mikrofluidik elektroporasyon, düşük girdili genom düzenleme için umut vadeden bir yaklaşım olarak ortaya^{çıkmıştır 4}. Ancak, mevcut platformların çoğu, karmaşık sıvı işleme, reaktiv karıştırmada sınırlı esneklik ve nispeten yüksek şart başlı hücre gereksinimleri içeren sürekli akış mimarislerine dayanır. Buna karşılık, dijital mikrofluidikler (DMF), düzlemsel elektrot dizisi üzerinde ayrık nanolitre ölçekli damlaların aktif manipülasyonunu sağlar; böylece reaksiyon bileşimi, zamanlama ve mekansal lokalizasyon üzerinde hassas kontrol sağlanır. Bu tak-çalıştır damlalı format, birincil hücrelerin ve reaktiflerin korunmasının önemli olduğu düşük hacimli, yüksek verimli iş akışları için oldukça uygundur⁵.

Son çalışmalar, verimli RNP ve mRNA teslimatı için yerel, düşük akımlı elektrik alanları üreten ve termal ve elektrokimyasal gerilimi en aza indiren üç damlacıklı elektroporasyon mimarileri kullanılarak DMF tabanlı hücre içi teslimatın ^{uygulanabilirliğini göstermiştir 6,7,8}. Bu temel üzerine inşa edilerek, 48 bağımsız adreslenebilir reaksiyon noktası, tam otomasyon uyumluluğu ve ölçeklenebilir kartuş^{üretimi 9} (Şekil 1) içeren 'DMF-ection' adlı yeni nesil DMF elektroporasyon platformu geliştirildi. DMF kartuşu, alt PCB plakası ve bir conta ile ayrılmış plastik üst plakadan oluşur ve hizalama patlatmalarıyla tek doğru bir konumda monte edilir (Şekil 1A). 48-plex düzeni, sekiz özdeş aileye ayrılmıştır (Şekil 1A–H), her biri altı bağımsız adreslenebilir elektroporasyon noktası içerir ve her kartuş başına 48'e kadar paralel düzenleme koşullarını destekler (Şekil 1B). Kılavuz RNA kütüphaneleri, kartuş montajından önce akustik bir dağıtıcı kullanılarak substrat yüzeyine yerleştirilir. Depolama pozisyon doğruluğu, tüm 48 noktada doğrulandı; bırakma pozisyonları elektrodun orta noktasından milimetre altı sapma içinde kümelenmiş (Şekil 1C), böylece güvenilir kartuş üzerinde RNP montajı sağlandı. Yüklemeden sonra, hücreler ve sıvı elektrot damlacıkları kartuş üzerinde aktiflenerek üç-damlacık elektroporasyon geometrisi oluşturulur (Şekil 1D). Elektroporasyondan sonra, hücreler geri kazanım ve sonraki akış analizi için kültür plakalarına boşaltılır; akış sitometrisi, dizileme ve mikroskopi dahil olmak üzere (Şekil 1E). Bu sistem, standart küvet tabanlı yöntemlere göre 100 kat daha az hücre kullanarak yüksek verimli genom düzenlemesini mümkün kılarak düşük girdili ve yüksek verimli uygulamalarda genom mühendisliğine erişimi önemli ölçüde genişletir.

Bu çalışma, platformun performansını mRNA ve CRISPR–Cas9 ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri dahil olmak üzere birden fazla biyomoleküler yük taşıyarak değerlendirerek verimli transfeksiyon ve gen bozulması sağlamaktadır. Birincil T hücrelerine ek olarak, DMF-eksiyon nüklein asitlerin karmaşık çok hücreli yapılara taşınması için genelleştirilebilir bir çerçeve sağlar. Üç boyutlu (3D) sferoidler ve organoid tipi modeller, mimari ve kırılganlıkları nedeniyle reaktifin nüfuzuna önemli engeller oluştururken, geleneksel elektroporasyon yaklaşımları genellikle morfolojiyi bozur veya heterojen teslimat üretir. T-hücre düzenlemesinde kullanılan aynı küçültülmüş elektroporasyon prensiplerinin yapılandırılmış dokulara da uygulanıp uygulanmadığını değerlendirmek için, DMF iş akışı 3D HEK293T sferoidlere uygulandı. Bu deneyler, DMF tabanlı elektroıslatmanın sağlam sferoidleri tri-damla geometrileri içinde nazikçe konumlandırabileceğini ve yapı ile büyümeyi koruyarak uniform mRNA iletimini destekleyebildiğini göstermiştir. Bu sonuçlar burada açıklanan birincil T-hücre protokolünün dışında olsa da, programlanabilir DMF elektroporasyonunun ilaç keşfi ve hastalık modellemesiyle ilgili yeni ortaya çıkan 3D hücresel sistemler için daha geniş uygulanabilirliğini göstermektedir.

Protokol

Bu protokolde kullanılan birincil insan T hücreleri, ticari tedarikçilerden bağışçı onayı ile ve ilgili kurumsal, etik ve düzenleyici yönergeler doğrultusunda temin edilmiştir. İnsan kaynaklı biyolojik materyallerin tüm işlenmesi kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulayan araştırmacılar, birincil insan hücrelerinin kullanımının yerel kurumsal inceleme kurulu (IRB) veya etik komite gerekliliklerine, geçerli biyogüvenlik düzenlemelerine ve insan biyolojik materyalinin kullanımını düzenleyen ilgili ulusal veya bölgesel mevzuatlara uygun olmasını sağlamakla yükümlüdür. Bu çalışmada kullanılan hücre materyaliyle hasta tarafından tanımlanabilir bir bilgi ilişkilendirilmemiştir.

1. Birincil insan T hücrelerinin hazırlanması ve aktivasyonu

1. Kriyokonseriflenen birincil insan CD3⁺ T hücrelerini 37 °C su banyosunda hızla erit. Hücreleri önceden ısıtılmış bazal T-hücre ortamına aktarın ve 180 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve pelleti taze ortamda tekrar askıya alın.
2. Hücre konsantrasyonunu ve yaşamlılığını otomatik hücre sayacı kullanarak belirleyin.
3. Hücreleri, çözünür tetramerik antikor CD3/CD28 T-hücre aktivatör uyarıcısı (satıcı talimatlarına göre) ve 200 IU/mL IL-2 ile takviye edilmiş T-hücre kültür ortamında 1 ×^{10 6} hücre/mL ortamında yeniden süzülür. Hücreleri 72 saat boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka edin.
   NOT: Aktivasyon sırasında hücre yoğunluğunu 0.5–2 × 10⁶ hücre/mL arasında tutun. U-bottom 96-kuyu plakalarında aktivasyon gerçekleştirerek hücreden aktivatörün temasını ve aktivasyon verimliliğini optimize etmeye çalışın.

2. DMF substratı üzerinde rehber RNA noktalarının hazırlanması (akustik dağıtıcı lekelendirme)

1. Nükleazsız suda liyofilize sgRNA'yı 100 μM stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırın. Ayrı bir tüpte, nukleazsız suda 100 mg/mL poli-L-glutamik asit (PGA, sodyum tuzu, MW 15.000–50.000 Da) stok hazırlanır. SgRNA ve PGA stokunu 5:4 hacim oranında (sgRNA: PGA) birleştirin; böylece nihai sgRNA konsantrasyonu 55,6 pmol/μL ve nihai PGA konsantrasyonu 44,4 mg/mL olarak nükleazsız suda elde edilir. Girdap kısa süreliğine 1.000 × g'de 30 saniye boyunca santrifüj yapar ve tek kullanımlık hacimlere aliquot yapar, kullanılmayan aliquotları −80 °C'de 6 aya kadar depolar.
   NOT: Tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
2. Rehber-PGA karışımını, istenen reaksiyon alanı düzenine uygun olan kuyularda düşük ölü hacimli akustik kaynak plakasına ekleyin.
3. Kılavuz-PGA karışımının 40 nL (2.2 pmol sgRNA'ya eşdeğer) her hedef tespit bölgesine kalibre edilmiş akustik dağıtıcı kullanılarak aktarıl.
   NOT: 55.6 pmol/μL olduğunda, 40 nL her bir bölge başına 2.2 pmol sgRNA sağlar (55.6 × 0.040 = 2.22 pmol). Kurutulmuş kılavuzlar, kartuş üzerinde damla birleşmesi sırasında yeniden oluşturulur; Tam yeniden askıya alınması, siteler arasında tutarlı düzenleme verimliliğiyle doğrulanır.
4. Biyolojik bir güvenlik kabinde, benekli damlaların oda sıcaklığında tamamen hava kurumasına izin verin, ta ki görünür bir sıvı kalmayana kadar (yaklaşık 5 dakika).
   NOT: Zorunlu hava akışı veya ısı kullanmayın, çünkü bu kılavuz RNA'yı yerinden çıkarabilir veya bozabilir.
5. DMF kartuşunu birleştirin.
   1. Biyolojik bir güvenlik kabinde, üst plakanın asimetrik plastik kırılma özelliklerini alt plakadaki çentiklerle eşleştirerek üst plakayı benekli alt taban üzerinde hizala. Kısa kenarlar boyunca eşit, eşzamanlı baskı uygulayın, böylece kilitleme özelliklerinin tam olarak bağlandığını kesin mekanik bir çıtırtı hissedilene kadar.
      NOT: Kartuş tek doğru yönde tasarlanmıştır; yanlış montaj snap yapmaz. Substratları her zaman kenarlarından tutun, böylece kontaminasyon veya fonksiyonel yüzeylere zarar vermeyin ve yüzey kaplamalarını birbirine kaydırmaktan kaçının; çünkü bu yüzey kaplamalarını çizebilir.
   2. Kontrol noktası: Mekanik çıtla doğru montajı onaylayın.
      NOT: Kaplama bütünlüğüne dair ön elektrik göstergesi yoktur; yanlış montajdan kaynaklanan fonksiyonel arızalar otomatik olarak tespit edilir ve çalışma sonrası kalite kontrol raporunda bildirilir.
      Duraklama noktası: Kullanılmayan montaj edilmiş kartuşları, oda sıcaklığında 48 saate kadar saklayacak şekilde kapatılmış bir pakette kurutucu (silika jel paketleri) ile saklayın.

3. Hücre hazırlığı

1. Her kullanımdan önce 1 mL Tam Transfeksiyon Tamponu taze hazırlanır; DMF uyumlu elektroporasyon tamponu, sağlanan biyouyumlu iyonik olmayan yüzeyaktif madde ile 20:1 (v/v) oranında (elektroporasyon tamponu: yüzey aktif madde) birleştirilir ve nihai %0,05 (v/v) yüzey aktif madde konsantrasyonu elde edilir. Nazik karıştırın ve buz üzerinde kalın.
   NOT: Burada kullanılan DMF uyumlu transfeksiyon tamponu düşük iletkenlikli, izotonik bir tampondur (iletkenlik: 3,5 mS/cm, osmolalite: 305 mOsm/L). Alternatif tamponlar kullanan araştırmacılar, DMF aktuasyonu ve hücre canlılığı ile uyumluluğu doğrulamalıdır. Biyouyumlu iyonik olmayan yüzeyaktif madde, damlacık sabitlenmesini azaltır; Eğer sağlanan yüzey aktif madde kullanılmazsa, uygun bir ikame vardır.
2. Aktive edilmiş T hücrelerini Transfeksiyon Tamponu ile bir kez yıkayın (yüzey aktif madde içermeden). 180 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın, süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini Tam Transfeksiyon Tamponunda (yüzeyaktif madde içeren) 1.0 × 10⁷ hücre/mL ile 10 7 hücre ile kartuş başına toplam 100 μL hacimde yeniden süsküyünüz. Buzda kal.
3. Kartuşu yüklemeden hemen önce, Cas9 nükleazını doğrudan 100 μL T-hücre süspansiyonuna ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın; Buzda kal.
   NOT: Birincil T hücreleri için, Cas9 100 μL kartuş hacmi başına 42 pmol (0.42 pmol/μL) ile yüklenir. Her elektroporasyon sitesi yaklaşık 1 μL hücre süspansiyonu işliyor ve her düzenlemede 0.42 pmol Cas9 sağlıyor. Bu dozu diğer bağışıklık hücre tiplerine uyum sağlarken optimize edin ( bkz. Tablo 1).

Bileşen	Düzenleme başına nihai yoğunlaştırma
Cas9	0.42 pmol ~1 μL damlada
sgRNA	2.1 pmol (40 nL spot'tan)
PGA	44,4 mg/mL stok lekeleme karışımında
Yüzeyaktif madde	%0,05 (v/v)
Hücre girişi	~10.000 hücre

Tablo 1: Her transfeksiyon damlasında nihai konsantrasyonların özet tablosu.

4. DMF-ection platformunda transfeksiyon

1. Çok kanallı pipet kullanarak, 8 hücre yükleme portunun her birine 10 μL T-hücre/Cas9 karışımı ve 16 sıvı elektrot yükleme portuna 10 μL tam Transfeksiyon Tamponu dağıtın ( Şekil 1'de gösterildiği gibi).
2. Voltajı 500 V'a, darbe süresini 3 ms'ye ve darbe sayısını 2'ye ayarlayın. Elektroporasyon dizisini platform talimatlarına göre başlatın.
   1. Kontrol noktası: Koşudan hemen sonra koşu sonrası QC raporunu inceleyin. Sporadik arızalar (

5. Düzenlenmiş T hücrelerinin boşaltılması ve geri kazanılması

1. Sıvı işleyici kullanarak, her reaksiyon noktasından elektroporlu hücreleri, 150 μL önceden ısıtılmış bazal T-hücre ortamı içeren 96 kuyuyla U-taban plakasına aktarın ve 200 IU/mL IL-2 ile desteklenir.
2. Hücreleri 72 saat boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta inkübe ederek protein dönüşümü ve yüzey reseptör ekspresyonu değişikliklerine izin verilebilir.

6. TRAC etkisinin akış sitometrisi analizi

1. Hücreleri, yıkamalar arasında hücre kaybını azaltmak için steril 96 kuyruklu konik alt plakaya aktarın. Hücreleri Akış Sitometri Tamponu (1× PBS, %2 FBS, 2 mM EDTA) ile iki kez yıkayın; 400 × g sıcaklıkta 5 dakika santrifüj yapın ve üst tabakayı nazikçe ters çevirerek üst tabakayı çıkarın. Hücreler plakada pellet halinde kalır.
2. Üretici önerdiği konsantrasyonlarda Flow Cytometry Buffer'da anti-CD4, anti-CD8 ve anti-TCRα/β antikorları içeren yüzey boyama master karışımı hazırlayın. Her kuyuya 25 μL ana karışım ekleyin ve ışıktan korunan 4 °C'de 20 dakika kuluçka yapın. 1× PBS ile (FBS olmadan) iki kez yıkayıp 400 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri 100 μL 1× PBS içinde 1:1.000 (v/v) oranında canlılık boyası içeren bir şekilde yeniden süzülün ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Konik alt plakalar pelet hücrelerini etkilidir; Hücrelerin tüm adımlarda iyi bir şekilde yeniden süspansiyonda olduğundan emin olun.
3. Hücreleri Akış Sitometri Tamponu ile iki kez yıkayın ve her örnek için 150–200 μL içinde tekrar süzülerek alın.
4. Sitometreyi, kullanılan florokromlar için uygun lazer çizgileri ve filtre setleriyle yapılandırın (örneğin, canlılık boyası için 488 nm uyarılma; uygun yüzey işaretleyicileri için 405 nm veya 488 nm). Tek boyalı telafi kontrolleri ve lekesiz bir örnek kullanarak voltajları ayarlayın. Her örnek için en az 5.000 canlı singlet etkinliği toplayın. Kapı ardışık olarak açılır: Saçılma tekleteleri → canlı hücreler (canlılık boyası negatif) → CD4⁺ veya CD8⁺ → TCRα/β ekspresyonu.
   NOT: Standart koşullarda, hücrelerin çoğalma süresi olduğu süreyle, yıkama ve boyama sırasında kaybedilen her örnek için toplam canlı olay 5.000'den 10.000'in üzerine kadar değişebilir.
5. CD4⁺ ve CD8⁺ popülasyonlarındaki TCRα/β-negatif hücrelerin sıklığını ölçerek TRAC gen bozulmasını belirleyin. Her alt küme için canlı singlet kapısına göre TCRα/β-negatif hücrelerin yüzdesi olarak knockout verimliliğini bildirin.

Sonuçlar

Beklenen sonuçlar
Her koşul başına 10.000 aktif T hücresinin elektroporasyonu genellikle >transfeksiyondan 72 saat sonra >95% 95 kullanılabilirlik ile %85 TRAC etkisi sağlar. Akış sitometrisi, TRAC hedefleme durumunda hedeflenmemiş sgRNA kontrolleri (NTC) ve herhangi bir elektrik alanına maruz kalmayan kontrollere kıyasla TCRα/β boyama kaybının net olduğunu gösterir. Aksi belirtilmedikçe, n bağımsız DMF koşularını ayrı günlerde gerçekleştirir. Aynı kartuş ser...

Tartışma

Bu protokol, nanolitre ölçekli damlalar kullanarak birincil insan T hücrelerine verimli hücre içi teslimatı sağlayan küçültülmüş dijital mikrofluidik elektroporasyon iş akışını tanımlar. Bu yöntemin temel avantajlarından biri, her reaksiyonda sadece 10.000 hücre kullanılarak CRISPR–Cas9 genom düzenlemesi yapılabilme yeteneğidir ve bu da geleneksel elektroporasyona kıyasla malzeme gereksinimlerini önemli ölçüde azaltmaktadır. Damla tabanlı mimari, otomasyonu destekler; çoklu paralel sitel...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Enstrümantasyon
1x PBS	Gibco		Akış Tamponu
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Sferoid protokolü
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Sferoid protokolü
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Enstrümantasyon
DMEM Media	Gibco	10564011	Medya Ekleme- Sferoid kültürü
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfeksiyon
DropGenie Transfection System	DropGenie		Enstrümantasyon
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Akış Tamponu
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Enstrümantasyon
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Medya Ekleme- Sferoid kültürü
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Enstrümantasyon
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Sferoid protokolü
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T hücresi medya eklemesi
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Periferik Kan, Kriyokorunamış, pan CD3+ Yardımcı T Hücreleri, Negatif Seçilmiş
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Hücresi Aktivasyon medya
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Hücresi Aktivasyon medya
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Enstrümantasyon
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Enstrümantasyon
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Medya Ekleme- Sferoid kültürü
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	100mg/ml kullanarak
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Yazılım
sNLS-SpCas9-sNLS Nükleaz	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Sferoid protokolü
Surfactant F	DropGenie		Transfeksiyon- DMF uyumlu tamponda 1:20 oranında kullanarak komple Transfeksiyon tamponu hazırlama
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Sferoid protokolü