Lipopolisakkarit ile Hasarlanmış Caco-2 Hücrelerinde miR-29b-3p Bağlanması Yoluyla NEAT1-Aracılı Bağırsak Bariyeri Disfonksiyonu

Özet

Bu çalışma, diyare baskın iritabl bağırsak sendromunda NEAT1'in diagnostik bir belirteç ve intestinal bariyer disfonksiyonunun bir regülatörü olarak değerlendirilmesini amaçlamıştır. NEAT1 düzeylerinin hasta serumunda arttığı, miR-29b-3p'ye bağlandığı ve nakavt edildiğinde lipopolisakkarit ile hasarlanmış Caco-2 hücrelerinde bariyer, apoptoz ve inflamatuar okumaların iyileştiği görülmüştür.

Özet

Diyare ağırlıklı irritabl bağırsak sendromunun (IBS-D) patogenezi belirsizdir ve mevcut tedaviler sınırlı kalmaktadır. Bu çalışma, IBS-D'de NEAT1'in tanısal değerini değerlendirmiş ve potansiyel düzenleyici mekanizmasını araştırmıştır. Toplam 116 IBS-D hastası ve 116 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Serum NEAT1 ve miR-29b-3p seviyeleri ters transkripsiyon kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) ile tespit edilmiş ve tanısal değeri değerlendirmek için alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri kullanılmıştır. Mekanizma çalışmaları için lipopolisakkarit (LPS) ile işlem görmüş bir Caco-2 intestinal epitel hücre modeli oluşturulmuştur. Hücre canlılığı Cell Counting Kit-8 (CCK-8) analiziyle, apoptoz akış sitometrisiyle, bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç (TEER) ile ve ZO-1, okludin ve klaudin-2 mRNA seviyeleri RT-qPCR ile değerlendirilmiştir. NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki bağlanma ilişkisini doğrulamak için çift-lüsiferaz raporlayıcı (DLR) ve RNA immünopresipitasyon (RIP) analizleri kullanılmıştır. IBS-D'li hastalarda NEAT1 yüksek düzeyde, miR-29b-3p ise düşük düzeyde eksprese edilmiş ve seviyeleri arasında güçlü bir negatif korelasyon görülmüştür. NEAT1 nakavtunun, LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde miR-29b-3p seviyelerini artırdığı, hücre canlılığını ve TEER'i iyileştirdiği, apoptozu azalttığı, ZO-1 ve okludin mRNA seviyelerini artırdığı, klaudin-2 mRNA seviyelerini düşürdüğü ve bariyer hasarıyla ilişkili okumaları hafiflettiği saptanmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde bu sonuçlar, serum NEAT1'in IBS-D için aday bir biyobelirteç olduğunu ve NEAT1/miR-29b-3p aksının intestinal bariyer disfonksiyonunda rol oynayabileceğini göstermektedir.

Giriş

İshal ile seyreden irritabl bağırsak sendromu (IBS-D); abdominal ağrı, abdominal distansiyon ve değişmiş bağırsak alışkanlıkları ile karakterize yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur¹. Günümüzde, IBS-D'nin patofizyolojik mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır². Tedavi yöntemleri çoğunlukla semptomatik rahatlamaya yöneliktir, sınırlı etkililiğe sahiptir ve nüks oranı yüksektir³. IBS-D'nin genellikle beyin-bağırsak aksı disregülasyonu, visseral hipersensitivite, düşük dereceli intestinal inflamasyon ve bariyer disfonksiyonu gibi birden fazla faktörün etkileşimini içerdiği kabul edilmektedir^4,5. Bu kriterler tanıyı bir dereceye kadar standardize etmiş olsa da, sübjektiftirler ve özellikle hastanın semptomları inflamatuar bağırsak hastalığı veya diğer organik hastalıklar ile örtüştüğünde tanısal gecikmelere veya yanlış sınıflandırmalara yol açabilirler. Rutin klinik pratikte, şu an için IBS-D için doğrulanmış objektif biyobelirteçler bulunmamaktadır. Bu nedenle, tanı koymada kullanılabilecek ve potansiyel terapötik değeri olan yeni bir moleküler hedef araştırmak, güncel IBS-D araştırma alanında acil bir ihtiyaç haline gelmiştir.

Son yıllarda, epigenetik düzenlemede kilit moleküller olan uzun kodlamayan RNA'lar, çeşitli hastalıklar genelinde tanısal belirteçler ve terapötik hedefler olarak büyük bir potansiyel göstermiştir^6,7. IBS-D'nin temel nedeni bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulmasıdır⁸. Sıkı bağlantı proteinlerinin yıkımı, mukozal bağışıklık yanıtını aktive eden "bağırsak sızıntısına" yol açar^9,10. Bağışıklık sisteminin aktivasyonu, bağırsak immün-sinir sistemini aktive ederek bağırsak disfonksiyonuna neden olabilecek çok sayıda pro-inflamatuar faktörün salınmasına yol açar. Çalışmalar, bazı lncRNA'ların bağırsak epitel bariyerini düzenleyebileceğini göstermiştir^11,12. NEAT1'in kolit hastalarının kolonik mukoza dokusunda yukarı yönlü düzenlendiği bildirilmiştir¹³. LncRNA NEAT1 inhibisyonu, ülseratif kolitte bağırsak epitel hücrelerindeki (IEC'ler) disfonksiyonu hafifletebilir¹⁴. Ancak, IBS-D'de NEAT1 ekspresyon profili ve tanısal değeri henüz araştırılmamıştır. Ayrıca, NEAT1 tanısal bir biyobelirteç olarak potansiyele sahip olabilir¹⁵. Eğer IBS-D hastalarının serumunda NEAT1 anormal şekilde eksprese ediliyorsa, bu durum moleküler bir tanı aracı sağlayarak mevcut Rome IV kriterlerini tamamlayabilir. Bu sırada, miRNA ekspresyon profili de IBS hastalarında önemli ölçüde değişmiştir. Örneğin, miR-29b-3p ekspresyonunun aşağı yönlü düzenlenmesi IBS patogenezi ile ilişkilendirilmiştir¹⁶. Ancak, IBS-D'de miR-29b-3p ekspresyonunu yöneten yukarı akış düzenleyici mekanizmalar tamamen keşfedilmemiş durumdadır. Özellikle, bu mekanizma diğer hastalıklarda iyi tanımlanmış olsa da^17,18, IBS-D bağlamında NEAT1'in miR-29b-3p için rekabetçi endojen bir RNA (ceRNA) olarak rolü hiç araştırılmamıştır. Dahası, önceki çalışmalar öncelikle doku düzeyindeki ekspresyona odaklanmış olsa da, dolaşımdaki NEAT1'in IBS-D tanısı için non-invaziv bir serum biyobelirteci olma potansiyeli tamamen bilinmemektedir.

lncRNA-NEAT1'in, miR-29b-3p'yi süngerleyen bir ceRNA olarak hareket ederek IBS-D'de bağırsak bariyer fonksiyonunun düzenlenmesinde rol oynayabileceğini hipotez ediyoruz. Yukarıdaki araştırma geçmişine dayanarak, bu çalışma şunları amaçlamaktadır: (1) IBS-D hastalarının serumundaki NEAT1 ve miR-29b-3p seviyelerini ve bunların tanısal değerini değerlendirmek; (2) NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki doğrudan bağlanma etkileşimini doğrulamak; ve (3) LPS ile işlem görmüş bir Caco-2 hücre modeli kullanarak bağırsak bariyer bütünlüğü ve inflamasyonun düzenlenmesinde NEAT1/miR-29b-3p aksının fonksiyonel rolunu aydınlatmak.

Protokol

Hastaların dahil edilmesi

Tüm katılımcılar, araştırma içeriğini tam olarak anladıktan sonra yazılı bilgilendirilmiş onam vermiştir. Shanghai Pudong New Area People's Hospital Etik Kurulu bu araştırma protokolünü incelemiş ve onaylamıştır (No. 2024k007). Örneklem büyüklüğü G*Power kullanılarak hesaplanmıştır: seçilen test t-testi olup istatistiksel test, iki bağımsız örneklem arasındaki farkları tespit etmek üzere tasarlanmıştır. d = 0.5 etki büyüklüğü, α = 0.05 ve güç = 0.9 ile yapılan hesaplama, her gruba en az 86 deneğin dahil edilmesi gerektiğini göstermiştir. Deney sırasında oluşabilecek öngörülemeyen durumları hesaba katmak için her gruba 116 hasta dahil edilmiştir. Temmuz 2024 ile Temmuz 2025 tarihleri arasında Shanghai Pudong New Area People's Hospital'a başvuran IBS-D tanılı toplam 116 hasta, deney grubu olarak bu çalışmaya dahil edilmiştir. Dahil edilme kriterleri şunlardı: (1) Rome IV tanı kriterlerini karşılayan IBS-D; (2) kolonoskopide mukozada organik lezyon saptanmaması. Hariç tutma kriterleri: (1) inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), kolorektal kanser vb. olan hastalar; (2) diyabetik hastalar; (3) yakın zamanda abdominal cerrahi öyküsü olan hastalar ve (4) şiddetli kalp, karaciğer veya böbrek yetmezliği olan hastalar. Bu arada, hastaların yaş ve cinsiyet gibi demografik özelliklerine uygun 116 sağlıklı gönüllü, kontrol grubu olarak seçilmiştir. Sağlıklı kontrollerin kronik gastrointestinal hastalık öyküsü veya ilgili klinik semptomlarının olmadığı teyit edilmiştir. Tüm deneklerden beş mililitre periferik venöz kan alınmıştır. Süpernatant, daha sonraki RNA ekstraksiyonu öncesinde kriyokorunma amacıyla -80 °C ultra düşük sıcaklıkta bir buzdolabına aktarılmıştır.

Her katılımcı tarafından aşağıdaki klinik belirtileri kaydetmek için 10 günlük bir anket doldurulmuştur: (a) 10 puanlık görsel analog skala kullanılarak abdominal ağrı şiddetinin değerlendirilmesi; (b) anket süresince abdominal ağrının sıklığı (ağrılı gün sayısı); (c) dışkılama sıklığı (günlük maksimum dışkılama sayısı); (d) dışkı özelliklerini değerlendirmek için Bristol Dışkı Formu Ölçeği. Deneklerin duygusal durumu, Hastane Anksiyete ve Depresyon Ölçeği (HADS) kullanılarak değerlendirilmiştir.

Hücre kültürü ve modelleme

Caco-2 hücreleri, %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin–streptomisin içeren Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) besiyerinde, 37 °C ve %5 CO₂ sıcaklığındaki bir inkübatörde rutin olarak kültüre edildi. Caco-2 hücre hattı, olgun bağırsak epitel hücrelerine benzer morfolojik ve fonksiyonel özellikler sergileyerek, sıkı bağlantılara ve mikrovillüslere sahip polarize bir hücre monokatmanına kendiliğinden farklılaşır. LPS, bağırsak epitelyumunda inflamatuar bir yanıtı tetikler ve sıkı bağlantıları bozarak bağırsak geçirgenliğini artırır; bu süreç IBS-D'nin patolojik özelliklerine oldukça benzerdir. Ayrıca, LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinin, IBS ile ilişkili bariyer disfonksiyonu ve inflamasyonu modellemek için önceki çalışmalarda^19,20,21 yaygın olarak kullanılmış olması nedeniyle, bu çalışmada IBS-D'nin in vitro bir modelini oluşturmak için Caco-2 hücrelerinin lipopolisakkarit (LPS) ile tedavisi seçilmiştir. Hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaştığında, kültür besiyeri 5 µg/ml LPS içeren tam besiyeri ile değiştirilmiş²² ve hücreler 24 sa boyunca stimüle edilmiştir. LPS uygulanmadan konvansiyonel olarak kültüre edilen hücreler kontrol grubu olarak kullanılmıştır.

Hücre transfeksiyonu

Caco-2 hücrelerinde NEAT1 ve miR-29b-3p'nin rollerini araştırmak için Caco-2 hücreleri transfekte edildi. Hücreler şu şekilde altı gruba ayrıldı: 1. kontrol grubu (tedavi uygulanmadı); 2. LPS grubu; 3. LPS + si-NC grubu; 4. LPS + si-NEAT1 grubu; 5. LPS + si-NEAT1 + inhibitör NC grubu ve 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitör grubu. NEAT1'i hedefleyen iki küçük müdahale RNA'sı (si-NEAT1) tasarlandı ve sentezlendi: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) ve si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Negatif kontrol olarak hedef dışı rastgele bir sekansa sahip siRNA (si-NC) kullanıldı. Aynı zamanda miR-29b-3p inhibitörü ve bunun negatif kontrolü de sentezlendi. miR-29b-3p inhibitörü: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Negatif kontrol: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2 hücreleri 24 kuyucuklu plakalara ekildi ve üretici protokolü takip edilerek kültürler %60–70 konfluens düzeyine ulaştığında transfekte edildi. Kısaca, 50 nM son siRNA konsantrasyonu elde etmek için 1,25 µL siRNA, 25 µL düşük serumlu ortamda seyreltildi. miRNA inhibisyonu için, 2 µL miR-29b-3p inhibitörü veya negatif kontrolü, 25 µL düşük serumlu ortamda 100 nM son konsantrasyona seyreltildi. Ayrı olarak, 1,5 µL transfeksiyon reaktifi, 25 µL düşük serumlu ortamla karıştırıldı. Ardından seyreltilmiş siRNA (veya inhibitör/negatif kontrol), transfeksiyon kompleksini oluşturmak üzere seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile karıştırıldı ve hücrelere damla damla eklendi. Transfeksiyondan altı saat sonra, transfeksiyon karışımı taze tam ortamla değiştirildi ve hücreler, sonraki fonksiyonel analizlerden önce 48 saat daha inkübe edildi. Diğer deneylerden önce, knockdown veya inhibisyon verimliliği RT-qPCR ile doğrulandı.

Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR)

Belirtilen işlemlere tabi tutulan serum örneklerinden ve Caco-2 hücrelerinden toplam RNA izole edildi. Kısaca, her örnek 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ile lizlendi ve 200 µL kloroform ile birleştirildi. 4 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 × g santrifüj sonrası, üst sulu faz yeni bir tüpe aktarıldı, 500 µL izopropanol ile karıştırıldı ve 30 dakika boyunca −20 °C'de bekletildi. Örnekler daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 12,000 × g hızda santrifüj edildi. Elde edilen RNA peleti %75 etanol ile iki kez yıkandı, havada kurutuldu ve 20 µL RNase-free su içinde yeniden süspanse edildi. RNA verimi ve saflığı bir mikro-spektrofotometre ile ölçüldü ve yalnızca A₂₆₀/A₂₈₀ değerleri 1,8–2,0 olan örnekler kullanıldı. RNA, üreticinin protokolü takip edilerek cDNA'ya ters transkripsiyonla geçirildi. NEAT1, ZO-1, occludin, claudin-2 ve GAPDH tespiti için, 1× RT tamponu, 0,5 mM dNTP'ler, 0,5 µM oligo(dT) primeri, 200 U ters transkriptaz ve RNase-free su içeren her 20 µL'lik ters transkripsiyon reaksiyonu için 1 µg toplam RNA kullanıldı. Reaksiyon 37 °C'de 15 dakika boyunca gerçekleştirildi ve ardından 85 °C'de 5 saniye boyunca enzim inaktivasyonu yapıldı.

SYBR Green tabanlı bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak, şablon olarak cDNA ile kantitatif PCR gerçekleştirildi. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, ve claudin-2 ekspresyon seviyeleri gene özgü primerlerle ölçüldü. miR-29b-3p için referans gen olarak U6 kullanılırken, NEAT1 ve sıkı bağlantı (tight junction) ile ilişkili genleri normalize etmek için GAPDH kullanıldı. Bağıl ekspresyon, 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.

Hücre canlılığı analizi

Logaritmik fazdaki Caco-2 hücreleri, kuyuk başına 1 × 10⁴ hücre olacak şekilde 96 kuyucuklu plakalara ekildi. Her grupta 5–6 duble kuyucuk bulunacak şekilde; bir boş kontrol grubu (yalnızca kültür ortamı içeren), bir kontrol grubu (işlem görmemiş hücreler) ve bir deney grubu (farklı işlem koşulları altındaki Caco-2 hücreleri) oluşturuldu. Hücreler 0, 24, 48 ve 72 sa şeklinde dört farklı zaman noktasına ayrıldı. Ölçümler sırasında inkübatörün sürekli açılmasını önlemek için her zaman noktası için ayrı bir kültür plakası hazırlandı. Kültür süresinin ardından, her kuyucuğa hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek 10 µL CCK-8 solüsyonu eklendi. Sonrasında kültür plakası, 37 °C, %5 CO₂ içeren inkübatöre geri yerleştirildi ve 2 sa boyunca karanlıkta inkübe edildi. Her kuyucuğun absorbsansı, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak derhal 450 nm'de ölçüldü. Son olarak hücre canlılığı yüzde olarak ifade edildi.

Hücre apoptoz analizi

Apoptoz, Annexin V-FITC/PI boyamasının ardından akış sitometrisi ile nicelendirildi. Her tedavi grubundaki Caco-2 hücreleri hasat edildi ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez durulandı. Santrifüj işlemi 4 °C'de 5 dk boyunca 300 × g hızda gerçekleştirildi. Hücre peleti daha sonra 100 µL 1× bağlama tamponunda resüspande edildi ve ardından sırayla 5 µL Annexin V-FITC ve 5 µL PI eklendi. Nazikçe karıştırıldıktan sonra örnekler, oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dk boyunca inkübe edildi. Sonrasında, 300 µL 1× bağlama tamponu eklendi ve süspansiyon, 5 mL'lik bir akış sitometrisi tüpüne aktarılmadan önce dikkatlice karıştırıldı. Örnekler 1 saat içerisinde akış sitometrisi ile analiz edildi.

Transepitelyal elektriksel direnç (TEER)

Geçirgenlik, Caco-2 hücrelerinin TEER değerleri ölçülerek değerlendirilmiştir²³. Caco-2 hücreleri Transwell odacıklarına ekilmiş ve yoğun bir monokatman oluşturması için 21 gün boyunca kültüre edilmiştir. Her bir deneysel koşul altında altı bağımsız biyolojik tekrarlanan işlem ve ayrıca her koşul altında beş teknik tekrarlanan işlem gerçekleştirilmiştir. Deneysel işlemden önce ve sonra, her grubun TEER değerleri, etanolle sterilize edilmiş ve PBS ile dengelenmiş elektrotlar kullanılarak bir transmembran direnç ölçer ile ölçülmüştür. Kısaca, filtre membranı ile temastan kaçınmak için elektrodun uzun çubuğu bazolateral kültür ortamına, kısa çubuğu ise apikal kültür ortamına daldırılmıştır. Stabilizasyon sonrası direnç değeri (Ω) okunmuş ve üç tutarlı okuma elde edilene kadar ölçümler tekrarlanmıştır. Hücre içermeyen boş Transwell filtrelerinin direnci aynı koşullar altında ölçülmüş ve bu değer tüm deneysel okumalardan çıkarılmıştır. TEER (Ω·cm²) = (örnek direnci – boş filtre direnci) × etkili membran alanı. Veriler şu şekilde sunulmuştur: (deney grubu/kontrol grubu) × 100%.

Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA)

Farklı tedavi gruplarındaki Caco-2 hücrelerinin süpernatantları, 24 saatlik kültürden sonra toplandı. Tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), interlökin-6 (IL-6), interlökin-8 (IL-8) ve interlökin-1β (IL-1β) dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinlerin seviyeleri, üretici talimatlarına uygun olarak ticari ELISA reaktifleri kullanılarak ölçüldü. Analiz, talimatlara kesinlikle uygun olarak gerçekleştirildi. Örnekler ve standartlar, antikorlarla önceden kaplanmış kuyucuklara eklendi, ardından inkübe edildi ve yıkandı. Sonrasında, biyotinize deteksiyon antikoru eklendi. Bir başka inkübasyon ve yıkama işleminin ardından, horseradish peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidin eklendi. Son olarak, renk gelişimi için TMB substratı eklendi ve reaksiyon durdurma solüsyonu ile sonlandırıldı. Her bir kuyucuğun absorbansı, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak hemen 450 nm'de ölçüldü.

Western blot

Proteinler, belirtilen işlemlerden sonra proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu kullanılarak Caco-2 hücrelerinden izole edildi. Protein seviyeleri bicinchoninic acid (BCA) testi ile ölçüldü. Her örnek için, kuyucuk başına 30 µg protein yüklendi, %10 SDS-PAGE jellerinde çözümlendi ve PVDF membranlara aktarıldı. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildi ve ardından 4 °C'de gece boyunca ZO-1 (1:1.000), occludin (1:500), claudin-2 (1:1.000) ve GAPDH (1:5.000) karşıtı antikorlar ile inkübe edildi. Yıkama işleminin ardından membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP-konjuge ikincil antikorlar ile inkübe edildi. Bantlar, gelişmiş kemilüminesans (ECL) ile tespit edildi ve bant yoğunluğu ImageJ kullanılarak analiz edildi. GAPDH, yükleme kontrolü olarak kullanıldı.

Çift lusiferaz raporlayıcı (DLR) analizi

miR-29b-3p'nin NEAT1 dizisindeki potansiyel bağlanma bölgeleri ENCORI veri tabanı (https://rnasysu.com/encori/) aracılığıyla tahmin edilmiştir. Ardından, vahşi tip (WT) veya mutant (MUT) bağlanma bölgelerini içeren NEAT1 fragmanları pmirGLO raporlayıcı vektörüne klonlanmıştır. Oluşturulan rekombinant plazmid, miR-29b-3p mimikleri (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) veya inhibitörleri ve bunlara karşılık gelen negatif kontrolleriyle (mimik NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) birlikte hücrelere ko-transfekte edilmiştir. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra hücreler toplanmış ve ateş böceği lusiferaz ile renilla lusiferaz aktiviteleri, dual lusiferaz tespit reajeni kullanılarak belirlenmiştir. Renilla lusiferaz aktivitesi, standardizasyon için internal referans olarak kullanılmıştır.

RNA İmmünopresipitasyon (RIP) analizi

RIP analizi için, Caco-2 hücreleri hasat edildi, PBS ile durulandı ve proteaz ile RNase inhibitörleri eklenmiş 200 µL RIP lizis tamponunda buz üzerinde 15 dk inkübe edildi. Hücre lizatları 4 °C'de 10 dk boyunca 16,000 × g hızda santrifüj edildi ve her süpernatanttan 10 µL girdi kontrolü olarak saklandı. İmmünopresipitasyon için, 40 µL Protein A/G manyetik boncukları, 200 µL RIP yıkama tamponu içerisinde 5 µg anti-Ago2 antikoru veya normal IgG ile oda sıcaklığında 30 dk boyunca rotasyonda tutuldu. 500 µL RIP yıkama tamponu ile üç kez yıkandıktan sonra, 100 µL boncuk süspansiyonu 100 µL lizat ile birleştirildi, RIP yıkama tamponu ile final hacmi 1 mL'ye ayarlandı ve rotasyonla 4 °C'de gece boyu inkübe edildi. Ardından boncuklar 500 µL RIP yıkama tamponu ile beş kez yıkandı ve aynı tamponun 150 µL'si içinde yeniden süspanse edildi. Protein sindirimi, 15 µL proteinaz K (20 mg/mL) ve 15 µL %10 SDS eklenmesinin ardından 55 °C'de 30 dk boyunca çalkalama ile inkübasyon yapılarak gerçekleştirildi. Süpernatant toplandı, RNA ekstraksiyon reaktanı ile izole edildi ve gece boyu çöktürüldü. Daha sonra NEAT1 ve miR-29b-3p zenginleşmesi RT-qPCR ile değerlendirildi.

Hücre altı lokalizasyon analizi

Caco-2 hücreleri, üretici talimatlarına uygun olarak, referans verilen ticari olarak mevcut nükleer-sitoplazmik ayırma reaktifi kullanılarak nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlara ayrılmıştır. Bu iki bileşenden toplam RNA ekstrakte edilmiş ve NEAT1'in çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımı RT-qPCR ile tespit edilmiştir. Kalibrasyon, ayırma verimliliğinin göstergeleri olarak U6 (esas olarak nükleer) ve GAPDH mRNA'sı (esas olarak sitoplazmik) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

İstatistiksel analiz

Klinik serum örnekleri için yapılan güç analizi (t-testi, d = 0.5, α = 0.05, güç = 0.9), grup başına minimum 86 deneğin gerekli olduğunu göstermiştir. Çalışma sırasında oluşabilecek öngörülemeyen durumları hesaba katmak amacıyla, klinik olarak anlamlı farkları tespit etmek için her gruba 116 hasta dahil edilmiştir. Sürekli değişkenler için veri normalliği Shapiro-Wilk testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Tüm sürekli veriler normal dağılım gösterdiğinden (P > 0.05), parametrik analizler uygulanmıştır. Kategorik değişkenler ki-kare testi kullanılarak analiz edilmiştir. Hücre bazlı deneyler, her bir biyolojik replika için beş teknik replika olmak üzere altı bağımsız biyolojik replika içermektedir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İki sürekli değişken grubu arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi ile gerçekleştirilirken, birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey post hoc testi ile analiz edilmiştir. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlanmıştır.

Sonuçlar

NEAT1 ekspresyonu ve tanısal değeri

Sağlıklı kontrol (HC) grubuyla karşılaştırıldığında, IBS-D hastalarında NEAT1 ekspresyon seviyeleri belirgin şekilde daha yüksekti (P < 0.0001; Şekil 1A). Alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrisi ile gösterilen NEAT1 eğri altı alanı (AUC) 0,867 idi (95% CI: 0,821–0,913). Özgüllüğü %75,9 iken duyarlılığı %84,5 olarak belirlenmiştir (Şekil 1B). Bu durum, IBS-D hastalarının serumundaki anormal NEAT1 ekspresyonunun, hastalık için yeni bir tanısal biyobelirteç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.

Ek olarak, sağlıklı grup ve IBS-D gruplarındaki hastaların klinik verileri karşılaştırılmıştır. Sonuçlar; yaş, cinsiyet veya diğer özellikler açısından iki grup arasında anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir (P > 0,05). Bununla birlikte, HADS, bağırsak hareketleri ve dışkı formlarında anlamlı farklar tespit edilmiştir (P < 0,0001, Tablo 2). Karın ağrısı sıklığına gelince, 69 hasta ≥ 5 gün boyunca semptom yaşamış olup bu durum vakaların %59,48'ini oluşturmaktadır. Karın ağrısının şiddetiyle ilgili olarak, 72 hastanın skoru ≥ 5 çıkmış olup bu oran %62,07'dir (Tablo 2). Bu durum, IBS-D'li hastaların semptomları aracılığıyla kontrol grubundan net bir şekilde ayırt edilebildiği anlamına gelmektedir. Yükselmiş NEAT1 ile IBS-D semptomları arasındaki klinik ilişki göz önüne alındığında, bir sonraki adımda LPS ilele tedavi edilmiş Caco-2 hücre modeli kullanarak NEAT1'in bağırsak bariyer bütünlüğü üzerindeki fonksiyonel etkisini inceledik.

Düşük NEAT1 seviyelerinin LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde bağırsak bariyer hasarı ve inflamatuar yanıtlar üzerindeki etkileri

IBS-D'de görülen intestinal bariyer disfonksiyonunu ve düşük dereceli inflamasyonu modellemek için Caco-2 hücrelerini LPS ile tedavi ettik. Hücrelere LPS eklendiğinde, NEAT1 seviyeleri kontrol grubuna kıyasla yukarı regüle oldu. si-NEAT1 ile transfeksiyondan sonra, NEAT1 seviyesi LPS + si-NC grubuna kıyasla belirgin şekilde azaldı (P < 0.0001, Şekil 2A). LPS tedavisi, kontrol grubuna göre hücre canlılığını azalttı ve apoptozu artırdı. NEAT1 nakavt edildikten sonra, LPS + si-NC grubuna kıyasla hücre canlılığı arttı ve apoptoz oranı azaldı (P < 0.001; Şekil 2B,C). NEAT1 nakavt edildikten sonra, LPS ile azalan TEER önemli ölçüde geri kazandı (P < 0.0001, Şekil 2D). LPS, kontrollere kıyasla ZO-1 ve occludin mRNA ekspresyonunu azalttı ve claudin-2 ekspresyonunu artırdı; buna karşılık NEAT1 nakavtı bu değişiklikleri tersine çevirdi (P < 0.001, Şekil 2E-G). LPS tedavisi hücrelerde inflamatuar bir yanıtı tetikleyebilir. Hücrelerdeki pro-inflamatuar faktörler TNF-α, IL-6, IL-8 ve IL-1β seviyeleri kontrol grubundan daha yüksekti. NEAT1 nakavtından sonra, hücrelerdeki pro-inflamatuar faktör içerikleri si-NC grubuna kıyasla önemli ölçüde azaldı (P < 0.0001, Şekil 3A-D). Bu durum, düşük NEAT1 seviyelerinin LPS kaynaklı intestinal bariyer disfonksiyonunu ve inflamatuar yanıtları azalttığını ve NEAT1'in IBS-D progresyonuna katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Caco-2 hücrelerinde NEAT1'in doğrudan bağlanması ve miR-29b-3p üzerindeki etkileri

Caco-2 hücrelerinde, NEAT1 öncelikle sitoplazmada bulunur (Şekil 4A). NEAT1 ve miR-29b-3p'nin bağlanma bölgeleri ENCORI veri tabanı kullanılarak öngörülmüştür. Buna dayanarak, WT-NEAT1 ve MUT-NEAT1 dizilerini tasarladık (Şekil 4B). DLR deney sonuçları, miR-29b-3p mimiklerinin, mimic NC'ye kıyasla WT-NEAT1 enzimatik aktivitesini azalttığını, inhibitörlerinin ise inhibitor NC'ye kıyasla artırdığını göstermiştir. Buna karşılık, iki tedavinin hiçbirinin MUT-NEAT1 üzerinde herhangi bir etkisi olmamıştır (P < 0.0001, Şekil 4C). RIP analizi, NEAT1 ve miR-29b-3p'nin anti-IgG grubuna kıyasla anti-Ago2 fraksiyonunda belirgin şekilde bol olduğunu ortaya koyarak, ikisi arasında spesifik bir etkileşim olduğunu göstermiştir (P < 0.0001, Şekil 4D). Bu sonuçlar, NEAT1'in miR-29b-3p'ye spesifik olarak bağlandığını göstermektedir. Bu sırada, miR-29b-3p düzeyi, IBS-D hastalarında HC grubuna kıyasla belirgin şekilde azalmıştır (P < 0.0001, Şekil 4E). ROC eğrisinin AUC değeri 0,856 (%95 CI: 0,808–0,905), sensitivitesi %89,7 ve spesifitesi %71,6 olarak belirlenmiştir (Şekil 4F). Pearson korelasyon analizi, NEAT1 düzeyleri ile miR-29b-3p ekspresyonu arasında ters bir korelasyon olduğunu ortaya koymuştur (r = -0,744, P < 0.0001, Şekil 4G).

Düşük NEAT1 seviyelerinin LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde intestinal bariyer hasarı ve miR-29b-3p seviyeleri üzerindeki etkileri

LPS ile işleme tabi tutulmuş Caco-2 hücrelerinde, miR-29b-3p ekspresyonu kontrol grubuna kıyasla belirgin şekilde azalmıştır. si-NEAT1 ile transfeksiyon miR-29b-3p seviyelerini artırırken, miR-29b-3p inhibitörü ile transfeksiyon miR-29b-3p seviyelerini yeniden düşürmüştür (P < 0.0001, Şekil 5A). NEAT1 nakavtı hücre canlılığını artırmış ve apoptozu azaltmış olup, bu etkiler miR-29b-3p inhibitörü tarafından ortadan kaldırılmıştır (P < 0.01, Şekil 5B,C). LPS kaynaklı TEER düşüşü NEAT1 nakavtı ile geri döndürülmüş ve bu geri dönüş yeniden miR-29b-3p inhibitörü tarafından engellenmiştir (P < 0.0001, Şekil 5D). LPS uygulaması, kontrol grubuna kıyasla ZO-1 ve occludin mRNA ekspresyonunda azalmaya ve claudin-2 mRNA ekspresyonunda artışa yol açmıştır. NEAT1 nakavtından sonra, LPS + si-NC grubuyla karşılaştırıldığında miR-29b-3p seviyeleri artmış, ZO-1 ve occludin mRNA seviyeleri yükselmiş ve claudin-2 mRNA seviyeleri azalmıştır. miR-29b-3p inhibisyonundan sonra, LPS + si-NEAT1 + inhibitör NC grubuyla karşılaştırıldığında ZO-1 ve occludin mRNA seviyeleri azalmış ve claudin-2 mRNA seviyeleri artmıştır (P < 0.001, Şekil 5E-G). NEAT1 (öncelikle sitoplazmik alt tip olan NEAT1_1), miR-29b-3p için bir sünger görevi görür. NEAT1 nakavtı miR-29b-3p'yi serbest bırakarak, dolaylı olarak ZO-1 ve occludin'i yukarı regüle ederken claudin-2'yi aşağı regüle eder ve böylece LPS kaynaklı bariyer bozulmasını hafifletir. Bu sonuçlar, bu modelde miR-29b-3p'nin ZO-1 ve occludin ekspresyonunu pozitif yönde, claudin-2'yi ise negatif yönde regüle ettiğini ve NEAT1 nakavtının etkilerinin en azından kısmen miR-29b-3p aracılığıyla gerçekleştiğini göstermektedir.

Sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyon seviyelerini western blot analizi kullanarak daha detaylı inceledik. Şekil 5H'de gösterildiği gibi, NEAT1 nakavt işlemi, LPS + si-NC grubuyla karşılaştırıldığında LPS ile azaltılmış olan ZO-1 ve occludin ekspresyonunu artırmış ve claudin-2 ekspresyonunu baskılamıştır. Bununla birlikte, miR-29b-3p inhibitörü ile yapılan ko-transfeksiyon, LPS + si-NEAT1 + inhibitör NC grubuna kıyasla NEAT1 nakavtının koruyucu etkisini zayıflatmıştır. Bu sonuçlar, NEAT1 nakavtının, en azından kısmen miR-29b-3p'yi yukarı regüle ederek sıkı bağlantı proteini ekspresyonunu geri kazandırdığı ve böylece bağırsak bariyer fonksiyonunu iyileştirdiği sonucunu desteklemektedir.

Düşük NEAT1 seviyelerinin LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde bağırsak inflamasyonu ve miR-29b-3p ekspresyonu üzerindeki etkileri

LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde, LPS inflamatuar bir yanıtı tetiklemiştir. Pro-inflamatuar faktörler olan TNF-α, IL-6, IL-8 ve IL-1β seviyeleri, kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha yüksekti. NEAT1 susturulması sonrası, miR-29b-3p seviyeleri artarken, pro-inflamatuar faktörlerin seviyeleri si-NC ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede azalmıştır. miR-29b-3p inhibisyonu sonrası, inflamatuar faktörlerin seviyeleri tekrar artış göstermiştir (P < 0.0001, Şekil 6A-D). Bu nedenle, NEAT1 susturulması, en azından kısmen miR-29b-3p'yi yukarı regüle ederek inflamatuar sitokinlerin salınımını baskılamaktadır.

Bu sonuçlar, IBS-D hastalarının serumunda NEAT1 düzeylerinin anormal şekilde yükseldiğini ve NEAT1'in IBS-D hastalarını sağlıklı kontrollerden ayırmada yüksek bir AUC değerine sahip olduğunu göstermektedir. Mekanistik olarak, NEAT1 sitoplazmada miR-29b-3p'ye doğrudan bağlanarak onu izole eder. Hücresel modellerde ve fonksiyonel kurtarma deneylerinde, NEAT1 nakavt işleminin miR-29b-3p ekspresyonunu artırdığı, hücre sağkalımını ve TEER'i iyileştirdiği, apoptozu azalttığı ve pro-inflamatuar sitokinlerin salınımını hafiflettiği görülmüştür. Bu bulgular, NEAT1'in miR-29b-3p'yi inhibe ederek bağırsak bariyer bütünlüğünü negatif yönde regüle ettiği hipotezini desteklemekte ve NEAT1'in hedeflenmesinin IBS-D için potansiyel bir tanısal ve terapötik strateji sağlayabileceğini önermektedir.

Veri kullanılabilirliği:

Şekil ve tabloların temelini oluşturan ham veriler, Ek Dosya 1 (ham veri hesap tablosu) ve Ek Dosya 2 (düzenlenmemiş western blot görüntüleri) olarak sunulmuştur.

Şekil 1. IBS-D hastalarında NEAT1 ekspresyonu ve tanısal değeri. (A) Sağlıklı kontrollerden (HC, n = 116) ve IBS-D hastalarından (n = 116) alınan serumdaki NEAT1 ekspresyon seviyelerinin RT-qPCR ile tespiti; (B) IBS-D hastalarını sağlıklı kontrollerden ayırt etmek için NEAT1 ROC eğrisi analizi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (grup başına n = 116). **** P < 0.0001. Kısaltmalar: IBS-D = diyare ağırlıklı irritabl bağırsak sendromu; ROC = alıcı işletim karakteristiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. NEAT1'in Caco-2 hücrelerinde LPS ile indüklenen bağırsak bariyer hasarı üzerindeki etkisi. (A) si-NEAT1 transfeksiyonu, LPS ile indüklenen NEAT1 seviyelerini azaltır; (B) 0, 24, 48 ve 72. saatlerde CCK-8 analizi ile ölçülen hücre canlılığı. NEAT1 knockdown'ı hücre canlılığını artırır; (C) Annexin V-FITC/PI boyaması ile akış sitometrisiyle belirlenen apoptoz oranı. NEAT1 susturulması apoptoz oranlarını azaltır; (D) Caco-2 monokatmanlarında ölçülen transepitelyal elektriksel direnç (TEER). NEAT1 inhibisyonu hücresel TEER'i artırır; (E-G) RT-qPCR ile ölçülen (E) ZO-1, (F) occludin ve (G) claudin-2 mRNA ekspresyon seviyeleri. NEAT1 susturulması ZO-1 ve occludin mRNA ekspresyonunu yükseltir, claudin-2 mRNA seviyelerini düşürür. Veriler, altı bağımsız deneyden (grup başına n = 6) ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS kontrolle, LPS + si-NEAT1 ise LPS + si-NC ile karşılaştırılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Caco-2 hücrelerinde NEAT1 nakavtının LPS ile indüklenen pro-inflamatuar sitokin salınımı üzerindeki etkisi. (A-D) ELISA ile ölçülen hücre kültürü süpernatantlarındaki (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 ve (D) IL-1β konsantrasyonları. NEAT1 nakavtı, LPS ile indüklenen TNF-α, IL-6, IL-8 ve IL-1β seviyelerini azaltır. Veriler altı bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur (grup başına n = 6). **** P < 0.0001, LPS ile kontrol ve LPS + si-NEAT1 ile LPS + si-NC karşılaştırması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. NEAT1'in doğrudan bağlanması ve miR-29b-3p ile ilişkisi. (A) Caco-2 hücrelerinde nükleer-sitoplazmik fraksiyonasyon ile belirlenen NEAT1'in hücresel alt lokalizasyonu (U6: nükleer kontrol, GAPDH: sitoplazmik kontrol). NEAT1 ağırlıklı olarak sitoplazmada yerleşmiştir; (B) ENCORI veritabanından alınan miR-29b-3p için NEAT1'in öngörülen WT ve MUT bağlanma dizileri; (C) DLR analizi NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki bağlanma ilişkisini doğrulamıştır; (D) RIP analizi NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki bağlanma ilişkisini doğrulamıştır. A, C ve D'deki veriler altı bağımsız deneyin ortalama ± SD değerleridir (grup başına n = 6). (E) Sağlıklı kontrollerde (HC, n = 116) ve IBS-D hastalarında (n = 116) serum miR-29b-3p ekspresyon seviyeleri; (F) IBS-D hastalarını sağlıklı kontrollerden ayırt etmek için miR-29b-3p'nin ROC eğrisi; (G) IBS-D hastalarında NEAT1 ve miR-29b-3p seviyeleri arasındaki Pearson korelasyon analizi. NEAT1, miR-29b-3p ekspresyonu ile negatif korelasyon göstermiştir (r = -0,744, P < 0,0001). E'deki veriler ortalama ± SD'dir (grup başına n = 116). **** P < 0,0001. Kısaltmalar: WT = vahşi tip; MUT = mutant; DLR = çift lusiferaz raporlayıcı; RIP = RNA immünopresipitasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde NEAT1 knockdown'ının intestinal bariyer fonksiyonu ve miR-29b-3p üzerindeki etkileri. (A) NEAT1 knockdown'ı miR-29b-3p seviyelerini artırırken, miR-29b-3p inhibitörleri ile transfeksiyon miR-29b-3p ekspresyonunu azaltır. (B) CCK-8 analizi ile ölçülen hücre canlılığı. Düşük NEAT1 seviyeleri miR-29b-3p'yi artırarak hücre canlılığını geliştirir; (C) Akış sitometrisi ile belirlenen apoptoz oranı. Düşük NEAT1 seviyeleri miR-29b-3p'yi artırarak apoptoz oranını azaltır; (D) Düşük NEAT1 seviyeleri miR-29b-3p seviyesini yükselterek hücrelerin TEER değerini artırır; (E-G) (E) ZO-1, (F) occludin ve (G) claudin-2 mRNA ekspresyonu. Düşük NEAT1 seviyeleri miR-29b-3p'yi güçlendirerek ZO-1 ve occludin ekspresyonunu artırır ve claudin-2 mRNA ekspresyonunu azaltır. (H) Belirtilen işlem koşulları altında ZO-1, occludin, claudin-2 ve GAPDH protein ekspresyonunu gösteren temsili western blot görüntüleri. Veriler, altı bağımsız deneyden (grup başına n = 6) elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS ve kontrol, LPS + si-NEAT1 ve LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor ve LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC karşılaştırmaları. Kısaltmalar: miR-inhibitor = miR-29b-3p inhibitörü; TEER = transepitelyal elektriksel direnç. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde ve miR-29b-3p'de NEAT1 nakavtının inflamasyon üzerindeki etkileri. (A-D) Hücre kültürü süpernatantlarındaki (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 ve (D) IL-1β konsantrasyonlarının ELISA ile ölçümü. Düşük NEAT1 seviyeleri, miR-29b-3p'yi artırarak hücre süpernatantındaki TNF-α, IL-6, IL-8 ve IL-1β içeriğini azaltır. Veriler, altı bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur (grup başına n = 6). **** P < 0.0001, LPS ile kontrol arası, LPS + si-NEAT1 ile LPS + si-NC arası, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor ile LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC arası. Kısaltma: miR-inhibitor = miR-29b-3p inhibitörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen	Primer dizilimi
NEAT1 ileri primer	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 tersyüz (reverse)	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 ileri primer	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 ters yönde (reverse)	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin ileri primer	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Okkludin tersine çevirme	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 ileri primer	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 ters yönlü (reverse)	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p ileri (forward) primer	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p ters (reverse)	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH ileri primer	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH ters (primer)	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 ileri primer	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 ters yönlü	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tablo 1: Primer dizileri.

İndikatör	Kontrol grubu (N=116)	IBS-D grubu (N=116)	P
Yaş, yıl
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
Cinsiyet
Erkek	64	66	0.895
Kadın	52	50
Sigara kullanımı
HAYIR	58	53	0.599
EVET	58	63
Alkol kullanımı
HAYIR	63	58	0.599
EVET	53	58
HADS, skor
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
Bağırsak hareketleri, sayı/gün
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
Dışkı formu, Bristol skoru
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
Karın ağrısı sıklığı, gün sayısı
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Karın ağrısı şiddeti, skor
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tablo 2: Sağlıklı kontroller ve IBS-D hastaları arasındaki demografik ve klinik özelliklerin karşılaştırılması. Değerler, her grup için katılımcı sayıları olarak bildirilmiştir (n = 116/grup). Gruplar arası farklar ki-kare testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Kısaltma: HADS = Hastane Anksiyete ve Depresyon Ölçeği; IBS-D = ishal ağırlıklı irritabl bağırsak sendromu.

Ek Dosya 1: Şekil ve tabloların temelini oluşturan ham veriler. Bu dosya, şurada gösterilen nicel sonuçların oluşturulmasında kullanılan ham sayısal verileri içermektedir Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5ve Şekil 6, ve demografik/klinik veriler şurada özetlenmiştir Tablo 2.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Düzenlenmemiş western blot görüntüleri.Bu dosya, Şekil 5H'de gösterilen temsilci western blot paneline karşılık gelen ZO-1, occludin, claudin-2 ve GAPDH için düzenlenmemiş western blot görüntülerini içermektedir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

IBS-D, yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur. Patolojik mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. Son yıllarda, epigenetik düzenlemede anahtar moleküller olan lncRNA'lar, hastalık teşhis ve tedavisi alanında büyük potansiyel göstermiştir. LncRNA NEAT1; kolorektal kanser²⁴, gliyom²⁵ ve miyokard enfarktüsü²⁶ gibi çeşitli hastalıklar üzerinde çalışılmıştır. Çok sayıda çalışma, NEAT1'in inflamatuar yanıtların¹³, hücre proliferasyonunun²⁷ ve bağırsak bariyer bütünlüğünün²⁸ düzenlenmesinde rol oynadığını göstermiştir. Ancak, NEAT1'in IBS-D'deki spesifik ekspresyonu, klinik değeri ve IBS-D'nin temelindeki düzenleyici mekanizmalar henüz derinlemesine araştırılmamıştır.

NEAT1, pnömoni²⁹, osteoartrit³⁰, rinit³¹ ve sepsis³² gibi çeşitli inflamatuar durumlarda yukarı regüle edilmektedir. Sonuçlarımız, bu çalışmalarda bildirilenlerle uyumludur: NEAT1 ekspresyonu IBS-D hastalarında anlamlı derecede yukarı regüle edilmiştir. Bu durum, IBS-D başlangıcı ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. Günümüzde IBS-D tanısı öncelikle Rome IV semptom kriterlerine dayanmaktadır ve mevcut herhangi bir objektif laboratuvar biyobelirteci bulunmamaktadır. Bu kriterler araştırma ve birçok klinik ortamda etkili olduğunu kanıtlamış olsa da sübjektiflik, diğer hastalıklarla semptom örtüşmesi ve tanısal gecikmeler dahil olmak üzere çeşitli kısıtlılıklara sahiptir. Daha ileri ROC eğrisi analizi, NEAT1'in IBS-D hastalarında nispeten iyi bir tanısal değere sahip olduğunu göstermektedir. Serum NEAT1 ekspresyon seviyeleri, 0,867 AUC değeri ile yüksek sensitivite ve spesifite sağlayarak IBS-D hastalarını sağlıklı kontrollerden etkili bir şekilde ayırmaktadır. Bu durum, NEAT1'in tanı için Rome IV kriterlerini tamamlayıcı bir araç veya IBS-D için yeni bir tanısal belirteç olarak gelecek vaat ettiğini göstermektedir. Örneğin, kronik abdominal ağrı ve bağırsak alışkanlıklarında değişikliklerle başvuran ve NEAT1 seviyeleri yüksek olan hastalar, biyobelirteç sonuçları Rome IV kriterleri ile birlikte değerlendirildiğinde daha büyük bir güvenle değerlendirilebilir. Bu durum, semptom hedefli tedavinin erken başlatılmasını kolaylaştırır ve gereksiz invaziv incelemelerin önüne geçer. Aksine, biyobelirteç sonuçları normal olan ancak Rome IV kriterlerini karşılayan hastalar için, diğer organik hastalıkları dışlamak amacıyla daha yakın izlem gereklidir. Bu nedenle, klinik ortamlarda prospektif validasyon hâlâ gerekli olsa da, bu biyobelirteçlerin klinik pratiğe entegre edilmesinin tanısal doğruluğu ve verimliliği artırması beklenmektedir.

IBS-D hastalarının yaşadığı klinik semptomlar, bozulmuş bağırsak bariyer fonksiyonu ile ilişkili olabilir³³. Bu fonksiyon öncelikle bağırsak epitelyal hücreleri arasındaki sıkı bağlantı (tight junction, TJ) yapısı tarafından yönetilir ve burada ZO-1 ile okludin proteinleri önemli roller oynar^34,35. ZO-1, mukozal epitelyumun mekanik bariyerinin ve geçirgenliğinin korunmasında rol oynar³⁶. Okludin, temel olarak hücreler arasında, bariyer fonksiyonlarının sürdürülmesi için kritik olan sıkı bağlantıların oluşturulmasından sorumludur³⁷. Sıkı bağlantı proteini claudin-2, diğer fonksiyonlarının yanı sıra hücre baypas gözenek kanallarının oluşumunda önemli bir rol oynar³⁸. IBS-D hastalarında ZO-1 ve okludin genellikle azalmış, claudin-2 artmış, bağırsak bariyeri hasar görmüş ve geçirgenlik artmıştır. Bu çalışma, NEAT1 nakavtunun in vitro hücre modelinin TEER değerini artırdığını bulmuş olup, bu durum NEAT1'in bu modeldeki bağırsak bariyeri üzerindeki yıkıcı etkisini desteklemektedir. Moleküler düzeyde, NEAT1 ekspresyonunun inhibisyonu, temel sıkı bağlantı proteinleri olan ZO-1 ve okludinin mRNA ekspresyon seviyelerinde belirgin bir yeniden artışa yol açarken, claudin-2 ekspresyonu azalmıştır. Bu durum, NEAT1'in sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu negatif olarak regüle ederek bağırsak epitelyumunun fiziksel bariyerini bozabileceğini ve geçirgenliğini artırabileceğini göstermektedir. Nihayetinde bu, 'sızdıran bağırsak' fenomenine yol açabilir. Ek olarak, IBS-D'de yaygın olan düşük dereceli inflamasyon, bariyer hasarını şiddetlendiren önemli bir faktördür³⁹. Çok sayıda çalışma, lncRNA'ların inflamatuar sinyal yollarında temel düzenleyici düğümler olarak hareket edebileceğini doğrulamıştır⁴⁰. Araştırmamız da bununla uyumludur. NEAT1 nakavutu, LPS tarafından indüklenen pro-inflamatuar sitokinler TNF-α, IL-6, IL-8 ve IL-1β salınımını önemli ölçüde azaltır. Bu durum, NEAT1'in diğer inflamatuar modellerdeki pro-inflamatuar lncRNA rolü ile oldukça benzerdir ve IBS-D'de NEAT1'in önemli bir rol oynadığı, inflamasyon-bariyer hasarı-inflamasyon şeklinde bir kısır döngünün olabileceğini göstermektedir.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), hastalık düzenlemesinde yer alan bir diğer önemli faktör sınıfıdır. miR-29b-3p, çeşitli LPS ile indüklenen hücresel inflamatuar yanıtlarda düşük düzeyde eksprese edilir^41,42. Çoğu çalışma ile tutarlı olarak, miR-29b-3p seviyelerinin IBS-D hastalarının serumunda belirgin şekilde azaldığını ve NEAT1 artışı ile güçlü bir negatif korelasyon gösterdiğini bulduk. Ayrıca, bu modelde NEAT1'in sitoplazmada doğrudan miR-29b-3p'ye bağlandığını ve onu süngerlediğini gösterdik. Fonksiyonel kurtarma deneyi, NEAT1'in Caco-2 hücrelerinin viyabilitesini ve apoptozunu, ayrıca ZO-1, occludin, ve claudin-2 mRNA seviyelerini, en azından kısmen miR-29b-3p aracılığıyla etkilediğini ve sonuç olarak bağırsak bariyer bütünlüğünü etkilediğini göstermiştir. Özellikle verilerimiz, IBS ile ilişkili bağırsak bariyeri disfonksiyonu bağlamında, miR-29b-3p seviyelerinin ZO-1 ve occludin seviyeleri ile pozitif korelasyon gösterdiğini belirtmektedir. Bu pozitif düzenleme dolaylı olabilir; örneğin miR-29b-3p, transkripsiyonel baskılayıcılarını hedefleyerek sıkı bağlantı proteinlerinin transkripsiyonunu baskılayabilir, böylece baskılamayı kaldırarak ZO-1 ve occludin ekspresyonunu teşvik edebilir. Bu hipotez, miR-29b-3p'nin bariyer fonksiyonunun negatif regülatörlerini hedefleyerek inflamatuar koşullarda koruyucu bir rol oynadığını bildiren önceki çalışmalarla da desteklenmektedir⁴².

Ancak, miR-29b-3p'nin ZO-1 ve occludin mRNA ekspresyonunu düzenlediği hedef genlerin, ceRNA ağını tamamlamak için daha fazla araştırılması gerekmektedir ki bu durum mevcut çalışmamızın bir kısıtlılığıdır. Ayrıca, çalışmamızın diğer kısıtlılıkları şunlardır: İlk olarak, bu çalışma nispeten küçük bir örneklem büyüklüğüne sahip (yalnızca 116 IBS-D hastası dahil edilen) tek merkezli bir çalışmadır. NEAT1'in klinik tanısal değerinin, geniş ölçekli, çok merkezli prospektif kohort çalışmalarıyla daha fazla doğrulanması gerekmektedir. İkinci olarak, bu çalışma temel olarak klinik ilişkilendirme analizlerine ve in vitro hücre modellerine dayanmaktadır. Gelecekte, bu eksenin in vivo rolünü doğrulamak için hayvan modellerine ihtiyaç duyulacaktır. Üçüncü olarak, miR-29b-3p'nin IBS-D patogenezinde rol oynayan spesifik downstream hedef gen ağı henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. Gelecek çalışmalar şunlara odaklanmalıdır: (1) NEAT1 ve miR-29b-3p'nin IBS-C ve IBS-M hastalarındaki tanısal değerinin doğrulanması; (2) NEAT1'i hedefleyen müdahalelerin terapötik etkinliğinin hayvan modellerinde test edilmesi ve (3) miR-29b-3p'nin sıkı bağlantı proteinlerini düzenleme şeklinin kesin moleküler mekanizmasının aydınlatılması. Bu tür çabalar, bulgularımızın klinik uygulamaya aktarılmasını kolaylaştıracaktır.

Sonuç olarak, NEAT1 IBS-D olan hastalarda yüksek düzeyde eksprese edilmektedir ve bu kohortta iyi bir tanısal değere sahiptir. Düşük NEAT1 seviyeleri, LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde miR-29b-3p seviyelerini artırarak hücre canlılığını destekleyebilir, apoptozu azaltabilir, intestinal bariyer hasarını hafifletebilir ve inflamatuar yanıtları baskılayabilir. NEAT1/miR-29b-3p aksı, IBS-D'nin karmaşık patofizyolojik mekanizmalarına dair yeni bir perspektif sunmaktadır. NEAT1, IBS-D için potansiyel bir tanısal biyobelirteç olarak hizmet edebilir ve NEAT1/miR-29b-3p aksı bu durum için potansiyel bir terapötik hedefi temsil edebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24 kuyucuklu plakalar	Corning	CLS3524	Hücre ekimi için
96 kuyucuklu plakalar	Corning	CLS3599	CCK-8 analizlerinde hücre ekimi için
Annexin V-FITC/PI apoptoz kiti	Invitrogen	V13242	Apoptoz oranlarının belirlenmesi için
Anti-AGO2 Monoklonal antikor	Proteintech	67934-1-Ig	Ago2-bağlı RNA komplekslerinin immün çöktürmesi için
Anti-Claudin-2 antikoru	Invitrogen	32-5600	Primer antikor, seyreltme 1:1000
Anti-GAPDH antikoru	Cell Signaling Technology	5174	Primer antikor, seyreltme 1:5000; yükleme kontrolü
Anti-Human IgG antikoru	Proteintech	10284-1-AP	RIP analizi için negatif kontrol olarak kullanılır
Anti-Occludin antikoru	Abcam	ab31721	Primer antikor, seyreltme 1:500
Anti-ZO-1 antikoru	Proteintech	21773-1-AP	Primer antikor, seyreltme 1:1000
Caco-2 hücreleri	SUNNCELL	SNL-068	Bağırsak epitelyal bariyer modelleri oluşturmak için
CCK-8 kiti	Solarbio	CA1210	Hücre Proliferasyon Analiz Kiti
Kloroform	Sigma-Aldrich	C2432	RNA ekstraksiyonunda faz ayrımı için
DMEM medyumu	Gibco	11965092	Hücre kültürü için
Dual-Luciferase Reporter Assay Kit	ThermoFisher	16186	Lusiferaz aktivitesini belirlemek için
ELISA kiti (IL-1β için)	R&D Systems	DY201	Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
ELISA kiti (IL-6 için)	R&D Systems	D6050B	Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
ELISA kiti (IL-8 için)	R&D Systems	NBP3-28022	Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
ELISA kiti (TNF-α için)	R&D Systems	DTA00D	Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratı	Thermo Fisher	32106	Protein bantlarını görüntülemek için
Ethanol (%75)	Sigma-Aldrich	459844	RNA peletini yıkamak için
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	10099141	Hücre kültürü için
Akış sitometresi	Beckman Coulter	B53002	Apoptoz oranlarını belirlemek için
HRP-konjuge sekonder antikorlar	Cell Signaling Technology	7074	ECL substratlarından kemilüminesans sinyal üretimini katalize eder
İzopropanol	Sigma-Aldrich	1133502500	RNA çöktürme için
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	Transfeksiyon reaktifi
Lipopolisakkarit (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Hücre modeli kurulumunu indüklemek için
Mikroplaka okuyucu	BioTek	Epoch 2	96 kuyucuklu plakalardaki örneklerin absorbansını belirlemek için
Nanodrop mikro-spektrofotometre	Thermo Scientific	ND-2000C	RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için
Yağsız kuru süt	Coolaber	CN7861	Membranları bloke etmek için (%5 çözelti)
PARIS Kiti	Thermo Fisher	AM1921	Nükleer-sitoplazmik fraksiyonlama için
Penisilin–Streptomisin	Gibco	15140122	Hücre büyümesi sırasında kontaminasyon direncini sağlamak için
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Protein konsantrasyonlarını belirlemek için
pmirGLO Dual-Luciferase vektörü	Promega	E1330	Dual lusiferaz rapor gen vektörü
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara	RR047A	RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu için
PVDF membran	Millipore	IPVH00010	SDS-PAGE sonrası protein transferi için
Real-time floresan kantitatif PCR cihazı	Applied Biosystems	4365464	Hedef genleri belirlemek için
RIPA liz tamponu (proteaz inhibitörleri ile)	Thermo Fisher	89901	Hücrelerden toplam protein ekstraksiyonu için
RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit	Sigma-Aldrich	17-701	Protein A/G Manyetik Boncuklar Kullanılarak RNA-Bağlayan Protein İmmün Çöktürme (RIP) Analizi
SDS-PAGE reaktifleri (%10 jel)	TargetMol	C0189	Proteinleri moleküler ağırlıklarına göre ayırmak için
SYBR Green master mix	Thermo Fisher	4309155	PCR testlerinde kullanım için
TEER ölçer (Volt-Ohm Metre)	Millipore	MERS00002	Transmembran Direnç Ölçer, Tek Katman Bütünlüğünü Ölçer
Transwell odacıkları	Corning Costar	CLS3413	Hücre monokatmanlarını kültüre etmek ve TEER ölçümü yapmak için
TRIzol reaktifi	Invitrogen	15596026CN	Toplam RNA ekstraksiyonu için